1、SN/T1961.9-20137检验步骤7.1DNA提取7.1.1称取300mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入600 L CTAB缓冲液和40L蛋白酶K,振荡混匀，6530min,期间每隔10min振荡混匀；7.1.2加入500L酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为25：24：1；强烈振荡，12000g离心15 min;7.1.3吸取上清液至一新离心管中，加人等体积异丙醇，振荡均匀，12000g离心10min;7.1.4弃去上清液，用预热至65的TE缓冲液溶解DNA;7.1.5加入5LRNA酶溶液，3730min;7.1.6加入200L三氯甲烷：异戊醇(24：1)，强烈振荡，12000
2、g离心15min;7.1.7吸取上清液至一新离心管中，加人等体积异丙醇，振荡均匀，12000g离心10min;7.1.8弃去上清液，70%乙醇洗涤一次，12000g离心1min;7.1.9弃上清液，晾干；加入50LTE缓冲液，溶解DNA沉淀。7.2DNA浓度和纯度的测定取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260m和280nm处的吸收值。DNA的浓度按照式(1)计算：c=A260N50/1000(1)式中：一双链DNA浓度，单位为微克每微升(g/uL);A260一260nm处的吸光值；W核酸稀释倍数。当浓度为10g/mL1004g/mL,A2o/A28
3、0比值在1.71.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。7.3实时荧光PCR检测7.3.1反应体系反应体系总体积为50L,其中含：样品DNA(10g/mL100g/mL)2L,引物(10mol/L)各2L,探针(10mol/L)1.5L,Tag DNA聚合酶(5U/L)0.5L,dNTP(10mmol/L)1L,10PCR缓冲液5L,水36L。真核生物内参照的反应体系同上，仅以真核生物引物对和探针替换杏仁引物对和探针。7.3.2反应参数预变性9510s,1个循环；9515s,6040s,同时收集FAM荧光，进行45个循环。7.3.3实验对照检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用杏仁提取的DNA作阳性对照，用已知不含杏仁成分的样品提取的DNA作阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。8质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
