1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 15562020代替 SN/T 15562005鸡传染性鼻炎检疫技术规范Quarantine protocol for chicken infectious coryza2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 11.220CSS B 41中华人民共和国海关总署发 布SN/T 15562020I前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件代替 SN/T 15562005鸡传染性鼻炎琼脂免疫扩散试验操作规程。本文件与 SN/T 15562005 相比，主要技术变化如下：增加了临床诊断方法；增加了病原分离鉴定方法；增
2、加了 PCR 检测方法；增加了血凝抑制试验（HI）；增加了间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。本文件主要起草人：陶虹、孙洁、张彩虹、林彦星、杨俊兴、林庆燕、秦智锋、刘建利、唐金明、陈书琨、廖立珊、曹琛福、吕建强、花群义。本文件所代替文件的历次版本发布情况为：SN/T 15562005。1SN/T 15562020鸡传染性鼻炎检疫技术规范1 范围本文件规定了鸡传染性鼻炎病原分离鉴定方法、聚合酶链式反应技术以及血清平板凝集试验、血凝抑制试验、间接酶联免疫吸附试验、鸡传染性鼻炎琼脂免疫扩散
3、试验的操作方法。本文件适用于鸡传染性鼻炎的诊断和检疫。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4诊断技术4.1 临床综合诊断鸡传染性鼻炎的临床症状及病理变化参见附录 A。4.2 病原分离鉴定4.2.1 试剂与材料4.2.1.1 灭菌棉拭子、鲜血琼
4、脂平皿、灭菌小瓶、过氧化氢酶。4.2.1.2 产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（或辅酶 1，NAD）表皮葡萄球菌。4.2.1.3 5%的二氧化碳（CO2）培养箱、4 或-20-30 冰箱。4.2.2 样品的采集和处理样品的采集、保存及运输应符合 GB/T 18088 和 SN/T 2123 的相关采样要求。无菌采集发病鸡血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4 或-20 -30 冰箱保存或冷藏条件下立即送检。无菌采集处于急性发病阶段（潜伏期 1 d7 d）的病鸡眶下窦内的黏液、浆液，或气管和气囊分泌物用于病原学诊断，其中眶下窦腔的细菌最为纯净。2SN/T 155620204
5、.2.3 细菌的分离鉴定无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中黏液或浆液。用棉拭子在鲜血琼脂平皿上横向划线 57 条，然后取产 NAD 表皮葡萄球菌从横线中间划一纵线。将划种好的平皿置于 5%的二氧化碳培养箱中 37 培养 18 h24 h，观察菌落特点。取可疑菌落的纯化物做过氧化氢酶试验，如有大量气泡者为过氧化氢酶阳性反应。也可采用 PCR 鉴定可疑菌落，同时取病料或可疑菌落进行动物试验，方法见附录 B。4.2.4 结果判定若鲜血琼脂培养基上出现“卫星样”生长的露滴状、针头大小的小菌落，即靠近产 NAD 表皮葡萄球菌线处菌落较大，直径可达 0.3 mm，离产 NAD 表皮葡萄球菌线越
6、远，菌落越小，过氧化氢酶阴性，结果判为阳性；若无卫星现象，但有露滴状、针头大小的小菌落出现且过氧化氢酶阴性，则仍需采用PCR 或动物试验鉴定，以避免漏检不需 NAD 的副鸡禽杆菌。若无上述现象，则判为阴性。4.3 PCR 检测4.3.1 试剂与材料4.3.1.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。4.3.1.2 0.5%Np-40（乙基苯基聚乙二醇）、0.5%吐温-20、100 mmol/L pH 8.3 Tris-HCl、0.2 mg/mL 蛋白酶 K、阴阳性对照物。4.3.1.3 生理盐水、蒸馏水、1.5 mL 及 0.5 mL 小离
7、心管、吸头，均灭菌处理。4.3.1.4 PCR 仪、水浴锅、小型离心机、微量加样器、冰块。4.3.1.5 琼脂糖、电泳仪、水平电泳槽、紫外灯或凝胶成像仪。4.3.1.6 10 mg/mL 溴化乙锭、加样缓冲液、TAE 电泳缓冲液。4.3.2 实验操作4.3.2.1 核酸抽提4.3.2.1.1 组织样品的核酸提取无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中的黏液或浆液浸入含 0.8 mL1.0 mL 生理盐水的 1.5 mL 离心管内，室温放置 0.5 h 后，将棉拭子在管壁上尽量挤干，然后弃至废液缸中。将浸过棉拭子的离心管以 8 000 r/min10 000 r/min 离心 10 min
8、，小心吸去大部分上清液，保留 20 L左右液体。用吸头将离心管中沉淀物与剩余液体混合均匀，加入 15 L 1 PCR 缓冲液（其中含 0.5%Np-40，0.5%吐温-20，0.2 mg/mL 蛋白酶 K 和 100 mmol/L pH 8.3 Tris-HCl），压紧离心管盖，约 50 水浴 1 h，然后 95 10 min，再冰浴 10 min 后进行 PCR 扩增或置-20 保存。4.3.2.1.2 菌落的核酸提取挑取于 5%的二氧化碳培养箱中 37 培养 18 h24 h 的菌落，加到含 10 L 蒸馏水的 0.5 mL 的小离心管中，压紧管盖，95 加热 10 min，再冰浴 10
9、min 后进行 PCR 扩增或-20 保存。用 10 L 无菌水作为阴性对照样品，用 9 L 无菌水加 1 L 已知阳性对照物作为阳性对照样品。约50 水浴 1 h，然后 95 10 min，再冰浴 10 min 后进行 PCR 扩增或置-20 保存。4.3.2.1.3 其他核酸提取方法可采用等效的商品化试剂盒进行细菌病原核酸提取。3SN/T 155620204.3.2.2 PCR 扩增针对副鸡禽杆菌 hagA 基因设计 PCR 检测引物：上游引物 P1：5 tgagggtagtcttgcacgcgaat 3下游引物 P2：5 caaggtatcgatcgtctctctact 3PCR 反应体
10、系为 25 L，其中 mix 12.5 L，ddH2O 5.5 L，P1 1 L，P2 1 L，DNA 模板 5 L。反应条件：95 5 min；95 30 s，59 30 s，72 45 s，35 个循环；72 10 min。扩增片段长度 510 bp，扩增序列参见附录 C。4.3.2.3 电泳制备 1.2%琼脂糖凝胶板。取 5 L PCR 产物与 2 L 上样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。加入分子量标准。盖好电泳仪，插好电极，60 V80 V 稳压电泳，30 min50 min。在紫外线灯下观察照相存档；或者用紫外凝胶成像仪扫描图片存档。用分子量标准比较判断 PCR 片段大小。4
11、.3.2.4 结果判定试验条件成立判定：阴性对照无目的条带、阳性对照在约 510 bp 处出现一条特异性的扩增条带，判定试验成立。检测样品出现一条分子量为 510 bp 条带，与阳性对照 PCR 产物同步迁移的大小相同条带，判为鸡传染性鼻炎核酸阳性；检测样品在约 510 bp 处没有任何特异性条带，与阴性对照相同，判为鸡传染性鼻炎核酸阴性。4.4 血清学检测4.4.1 血清平板凝集试验4.4.1.1 材料4.4.1.1.1 鸡传染性鼻炎平板凝集试验抗原、阴性对照血清、阳性对照血清，使用前与被检血清一起恢复至室温。4.4.1.1.2 载玻片、微量加样器 1 个、灭菌吸头。4.4.1.2 操作程序
12、4.4.1.2.1 本试验在室温（20 25）下进行。4.4.1.2.2 先在玻板背面写好编号，每个样品间至少留 20 mm 空隙，再在每个序号边加抗原 15 L。4.4.1.2.3 按玻板上的序号加对照或被检血清 15 L，每个血清样品换一个吸头，将血清与抗原混匀，反应持续 3 min5 min，在此时间内观察结果。每次试验均设阴性、阳性对照。4.4.1.2.4 在黑色背景或在灯下明亮处观察并记录结果。4.4.1.3 结果判定与表示方法血清平板凝集试验判定标准见表 1。4SN/T 15562020表 1 血清平板凝集试验判定标准编号反应表现判定记录符号定性区分1有明显架状或片状凝集片，液体清
13、亮强阳性+2有大量针头样颗粒，量多，液体较清亮阳性+3针头样颗粒状，量较少，稍混浊弱阳性+4液体无颗粒，均匀而混浊阴性-4.4.2 血凝抑制试验4.4.2.1 材料4.4.2.1.1 鸡传染性鼻炎血凝抑制试验抗原及阴、阳性对照血清，均由指定单位提供。4.4.2.1.2 生理盐水及被检血清。4.4.2.1.3 新鲜红血球悬液及醛化红血球悬液，制备方法见附录 D 中 D.2、D.3。4.4.2.1.4 96 孔微量血凝板（V 型）、微量振荡器、微量加样器及吸头。4.4.2.2 操作程序本操作在 20 25 范围内进行，同时用 A、B、C 型抗原分别对被检血清进行以下操作，以全面检测各型菌的感染情况
14、。取洁净血凝板，将抗原用生理盐水从 5 倍开始做 2 倍递增稀释加入 111 列孔中（即第 1 列孔为 5，第 2 列为 10，第 3 列为 20，依此类推至第 11 列），每孔最终液体量为100 L，第 12 列孔只加生理盐水作为血球对照孔。每孔加 1%相应的红血球 100 L（A 型抗原用新鲜红血球，B、C 型抗原用醛化红血球），充分振荡混合后，在室温静置 30 min60 min（以血球对照孔中红血球完全沉下为准）。判定抗原的血凝效价（HA 效价），即为使红血球发生完全凝集的抗原最大稀释倍数。被检血清的吸收：将被检血清用 10%相应的红血球进行 5 倍稀释（A 型抗原用新鲜红血球，B、C
15、型抗原用醛化红血球），室温下作用 4 h 或 4 过夜，中间充分振荡不少于 5 次，然后 1 500 r/min 离心10 min，取上清液即为 5 倍稀释的被检血清。取洁净血凝板，从第 1 列孔开始，用生理盐水将每份被检血清及阴性对照血清、阳性对照血清从 5 倍开始做 2 倍递增系列稀释，每行测定一份血清，每孔最终液体量为 50 L，将抗原用生理盐水稀释至浓度为 4 个 HA 效价单位（如 HA 效价为 1:160，则抗原稀释至 40 倍），每血清孔中加入 50 L。充分振荡，于室温下静置 30 min 以上。每孔加入 1%相应的红血球 100 L（A 型抗原用新鲜红血球，B、C 型抗原用醛
16、化红血球）。充分振荡，置室温下作用 30 min 60 min。分别判定被检血清样品血凝抑制（HI）效价，即完全抑制红血球凝集的最高血清稀释倍数。4.4.2.3 结果的判定与表示方法能完全抑制红血球凝集者判为阳性（HI 效价 1:5），阴性、阳性对照血清的结果应分别为阴性和阳性。4.4.3 间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）4.4.3.1 材料4.4.3.1.1 鸡传染性鼻炎 ELISA 抗原、阴性对照血清、阳性对照血清、羊抗鸡 IgG 酶标抗体。5SN/T 155620204.4.3.1.2 洗涤液、包被液、底物液及终止液，以上各溶液的配制方法见附录 D。4.4.3.1.3 稀释液：成分与配制方法同以上洗涤液。4.4.3.1.4 酶标仪、微量加样器（单道及多道）、37 恒温培养箱、酶标板、4 冰箱、吸头。4.4.3.2 操作程序4.4.3.2.1 抗原包被：将抗原用包被液稀释至工作浓度，加入酶标板各孔中，每孔 100 L，置 4 冰箱过夜。4.4.3.2.2 洗涤：甩净孔内抗原溶液，用洗涤液加满各孔，放置 5 min，然后甩净，如此重复 3 次。4.4.3.2.3 加被检血清：用