1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口食品中 硫丹和 硫丹残留量的检测方法酶联免疫法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犲 狀 犱 狅 狊 狌 犾 犳 犪 狀犪 狀 犱 犲 狀 犱 狅 狊 狌 犾 犳 犪 狀狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊犻 狀犳 狅 狅 犱 狊 狋 狌 犳 犳 犳 狅 狉犲 狓 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱 犻 犿 狆 狅 狉 狋犈 狀 狕 狔 犿 犲 犾 犻 狀 犽 犲 犱 犻 犿犿 狌 狀 狅 狊 狅 狉 犫 犲 狀 狋 犪 狊 狊 犪 狔犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布前言本标准附录 和附录
2、为规范性附录，附录和附录 为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、天津科技大学。本标准主要起草人：郑文杰、王硕、张宏伟、张燕、贺艳、刘火亘、林安清、赵卫东、魏亚东、吴延晖。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出口食品中硫丹和硫丹残留量的检测方法酶联免疫法范围本标准规定了进出口食品中硫丹和硫丹总残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于粮谷、蔬菜、茶叶、烟草、水果、肉及肉制品、虾中硫丹残留量的筛选检测。鱼类不适用酶联免疫法的测定，用胶体金试纸条法测定，方法见附录。测定方法 方法提要用甲醇或丙酮提取样品中 硫丹和
3、 硫丹，用竞争性酶联免疫法进行检测。试剂和材料除另有要求外，所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。甲醇。丙酮。亚铁氰化钾 。硫酸锌溶液 。磷酸氢二钠（）。磷酸二氢钠（）。氯化钠。无水醋酸钠。环糊精。过氧化氢脲。，四甲基对二氨基联苯。二甲基亚砜。磷酸盐缓冲液（）：见附录。吐温 。无水硫酸钠：灼烧，在干燥器内冷却至室温，贮于密封瓶中备用。鱼皮胶水溶液（保存保存）。掩蔽剂稀释液：鱼皮胶磷酸盐缓冲液（，体积比）稀释，于使用时配制。溶液：甲醇：掩蔽剂稀释液（，体积比）。酶标记物：辣根过氧化物酶和半抗原的结合物，保存，于使用时用磷酸缓冲液 倍稀释，酶标物稀释后不能继续使用。洗涤液，见附录。底物液，见附录。底
4、物液，见附录。终止液：硫酸 。、硫丹混合标准品（英文名称：、代码：）：纯度大于等于 。标准品贮备液：配制成 甲醇贮备液，保存。犛 犖犜 低温保存试剂，放置于室温不要超过，使用时，各溶液应达到室温。仪器和设备 粉碎机。旋涡混合器。气浴摇床。酶标仪。市售硫丹检测试剂盒。氮吹仪。单道微量加样器：，。多通道微量加样器：。制样 蔬菜（大白菜、蒜、葱、茼蒿、小松菜、甘蓝（绿、紫）、卢笋、姜、菠菜、胡萝卜、芹菜）：称取（精确到 ）粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入 甲醇，机械振荡（）。室温静置分层，吸取 上清液用掩蔽剂稀释液稀释 倍后进行测定，胡萝卜稀释 倍；芹菜稀释 倍。粮谷（红豆、绿豆、毛豆、花生）：称取（精确
5、到 ）粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入 甲醇，机械振荡（）。室温静置分层，吸取 上清液用掩蔽剂稀释液稀释 倍后进行测定。茶叶：称取（精确到 ）粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入 甲醇，机械振荡（）提取。室温静置分层，吸取 上清液用掩蔽剂稀释液稀释 倍后进行测定。烟草：称取（精确到 ）粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入 甲醇，机械振荡（）。静置 ，吸取 上清液用掩蔽剂稀释液稀释 倍后进行测定。肉类（牛肉、羊肉、鸡肉）：称取（精确到 ）粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入 甲醇，涡旋剧烈混合 ，过滤，吸取 上清液用掩蔽剂稀释液稀释 倍后进行测定。虾：称取（精确到 ）待测样，搅碎后加入 无水硫酸钠搅匀，再加入 丙酮、硫酸锌溶液和
6、亚铁氰化钾，涡旋混匀 ；于 离心 。取全部上清液氮吹至干；加入 甲醇水溶液，充分溶解，滤纸过滤。虾样的标准曲线用阴性样品提取液配制。酶联免疫法检测 标准曲线的制备用溶液稀释 的硫丹标准溶液储备液至 ，用溶液对 的硫丹标准溶液进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的硫丹标准溶液（，）。样品测定在酶标板中分别加入 不同浓度的硫丹标准溶液和样品待测液，在空白和对照孔中分别加入 的水。除空白孔外，在每个孔中加入 的酶标记物稀释液，空白孔中则加入 磷酸盐缓冲液，轻拍混匀，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，室温孵育 。弃掉酶标板中的液体，用洗涤液洗板次。加入混合好的底物液 ，轻轻混匀，室温放置 后，每个孔加入 的终
7、止液，轻轻晃动酶标板，内在酶标仪上读出每孔 、吸光值。结果的计算 计算抑制率值测定不同浓度硫丹对抗原抗体结合反应的抑制率见式（）：犐 犆 犃样品犃空白犃对照犃空白 （）犛 犖犜 式中：犐 犆 硫丹对抗原抗体结合反应的抑制率，：犃对照 吸光值与 吸光值的差值；犃样品 硫丹标准液或样液的平均吸光度值；犃空白 不加入酶标及硫丹标准液的平均吸光度值。绘制标准曲线以抑制率为纵坐标，硫丹浓度对数为横坐标绘制校正曲线。每次试验均应重新绘制标准曲线，见图。图硫丹标准曲线 结果计算从图绘制的标准曲线上读取样液抑制率所对应的硫丹浓度（犮），按式（）计算试样中的硫丹残留量：犡犮犚犕（）式中：犡 试样中硫丹残留量，单
8、位为微克每千克（）；犮 根据样品孔的抑制率查得试样中硫丹浓度，单位为微克每升（）；犚 某类样品换算系数，系数见表；犕 调整待测定液浓度使其在标准曲线范围内所稀释的倍数。表不同类样品的换算系数值食品名称牛肉、羊肉、鸡肉大白菜、蒜、葱、茼蒿、小松菜、甘蓝、芦笋胡萝卜芹菜、绿豆、红小豆、花生茶叶烟草虾犚值 检测低限、回收率 检测低限本方法检测低限见附录。回收率硫丹添加浓度和回收率的实验数据见附录。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）试剂犃 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液：磷酸盐 氯化钠，磷酸氢二钠（）磷酸二氢钠（）氯化钠（）调 值至。用水定容至。于保存。使用时，溶液应达到室温，用水稀释。犃 洗涤液洗涤液：磷酸盐
9、缓冲液 水 吐温 磷酸氢钠（）磷酸二氢钠（）氯化钠（）加水定容至，室温保存周周。使用时，用水稀释。犃 底物液犃 底物液犃无水醋酸钠 环糊精 过氧化氢脲 调 值至。加水定容至。于保存，使用时需达到室温。犃 底物液犅，四甲基对二氨基联苯（）二甲基亚砜（）使用前室温避光保存。使用时，按底物液 底物液为（体积比）混合使用。犛 犖犜 附录犅（规范性附录）鱼中 硫丹和 硫丹总残留量的检测方法胶体金试纸条法犅 样品提取称取（精确到 ）待测样，切碎后加入无水硫酸钠搅匀，再加入 甲醇，涡旋混匀 。过滤后氮吹至干，再加入 含 甲醇的磷酸盐吐温溶液稀释液待测。犅 检测将胶体金标记硫丹抗体原液与抗体稀释液按体积比混合
10、，取 样品提取液，加入 金标抗体稀释液混匀。取 上述混合液滴加到试纸条包被区域，待液体完全流过后，在质控线显色的情况下，目视检测线的颜色。将限量样品管加入含 甲醇的磷酸盐吐温溶液 ，溶解混匀，以此试剂代替样品待测液按上述方法操作，作为限量对照，样品测试带颜色比限量带浅，则判断为样品中硫丹含量超过限量。犅 检测低限检测低限。犛 犖犜 附录犆（资料性附录）酶联免疫方法的测定低限表犆 酶联免疫方法的测定低限样品检出限（）大葱 芹菜 胡萝卜 大白菜 茼蒿 甘蓝（绿）甘蓝（紫）大蒜 菠菜 小松菜 芦笋 样品检出限（）姜 红小豆 绿豆 毛豆 花生 茶叶 牛肉 鸡肉 羊肉 虾 烟草 犛 犖犜 附录犇（资料性
11、附录）硫丹添加浓度和回收率表犇 硫丹添加浓度和回收率样品添加水平 回收率大葱 芹菜 胡萝卜 大白菜 茼蒿 甘蓝（绿）甘蓝（紫）大蒜 菠菜 小松菜 芦笋 样品添加水平 回收率姜 红小豆 绿豆 乇豆 花生 茶叶 牛肉 鸡肉 羊肉 虾 烟草 犛 犖犜 犉 狅 狉 犲 狑 狅 狉 犱犜 犺 犲犃 狀 狀 犲 狓犃犪 狀 犱犅狅 犳 狋 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 犻 狊狀 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲犪 狀 狀 犲 狓 犜 犺 犲犃 狀 狀 犲 狓犆犪 狀 犱犇犻 狊 犻 狀 犳 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狏 犲犪 狀 狀 犲 狓犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊狆
12、狉 狅 狆 狅 狊 犲 犱犫 狔犪 狀 犱 犻 狊狌 狀 犱 犲 狉 狋 犺 犲犮 犺 犪 狉 犵 犲狅 犳犆 犲 狉 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犃 犮 犮 狉 犲 犱 犻 狋 犪 狋 犻 狅 狀犃 犱 犿 犻 狀 犻 狊 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔犜 犻 犪 狀 犼 犻 狀犈 狀 狋 狉 狔 犈 狓 犻 狋 犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀
13、 犲犅 狌 狉 犲 犪 狌狅 犳 狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪，犜 犻 犪 狀 犼 犻 狀犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔狅 犳犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲犪 狀 犱犜 犲 犮 犺 狀 狅 犾 狅 犵 狌 狔 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊犿 犪 犻 狀 犾 狔犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔 犠 犲 狀 犼 犻 犲犣 犺 犲 狀 犵，犛 犺 狌 狅 犠 犪 狀 犵，犎 狅 狀 犵 狑 犲 犻犣 犺 犪 狀 犵，犢 犪 狀犣 犺 犪 狀 犵，犢 犪 狀犎 犲，犡 狌 犪 狀犔 犻 狌，犠 犲 犻 犱 狅 狀
14、 犵犣 犺 犪 狅，犠 犲 犻 犱 狅 狀 犵犣 犺 犪 狅，犃 狀 狇 犻 狀 犵犔 犻 狀，犢 犪 犱 狅 狀 犵犠 犲 犻，犢 犪 狀 犺 狌 犻犠狌 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 犻 狊犪狆 狉 狅 犳 犲 狊 狊 犻 狅 狀 犪 犾 狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狆 狉 狅 犿 狌 犾 犵 犪 狋 犲 犱犳 狅 狉 狋 犺 犲犳 犻 狉 狊 狋 狋 犻 犿 犲 犛 犖犜 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犲 狀 犱 狅 狊 狌 犾 犳 犪 狀犪 狀 犱 犲 狀 犱 狅 狊 狌 犾 犳 犪 狀狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀犳 狅 狅 犱
15、狊 狋 狌 犳 犳 犳 狅 狉犲 狓 狆 狅 狉 狋犪 狀 犱 犻 犿 狆 狅 狉 狋犈 狀 狕 狔 犿 犲 犾 犻 狀 犽 犲 犱 犻 犿犿 狌 狀 狅 狊 狅 狉 犫 犲 狀 狋犪 狊 狊 犪 狔犿 犲 狋 犺 狅 犱犛 犮 狅 狆 犲犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犲 狊 狋 犺 犲犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊狅 犳 犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀犫 狔犈 犔 犐 犛 犃犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳，犲 狀 犱 狅 狊 狌 犾 犳 犪 狀 狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀犳 狅 狅 犱 狊 狋 狌 犳 犳 狊犳 狅 狉犲 狓
16、 狆 狅 狉 狋犪 狀 犱 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犲 狊 狋 犺 犲犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊狅 犳 犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀犫 狔犈 犔 犐 犛 犃犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳，犲 狀 犱 狅 狊 狌 犾 犳 犪 狀 狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀犵 狉 犪 犻 狀，狏 犲 犵 犲 狋 犪 犫 犾 犲 狊，犳 狉 狌 犻 狋，狋 犲 犪，狋 狅 犫 犪 犮 犮 狅，犿 犲 犪 狋犪 狀 犱犿 犲 犪 狋狆 狉 狅 犱 狌 犮 狋 狊、犪 狇 狌 犪 狋 犻 犮犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 犃 狀 犱狋 犺 犲犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犳 犻 狊 犺 犻 狊犮 狅 犾 犾 狅 犻 犱 犪 犾 犵 狅 犾 犱狊 狋 狉 犻 狆狊 犲 犲犃 狀 狀 犲 狓犅犕 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 犻 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀 犘 狉 犻 狀 犮 犻 狆 犾 犲狅 犳犱 犲 狋 犲 狉 犿