1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?贝类中失忆性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附法?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王秋艳、曹际娟、王刚、赵昕、郑惠芳、于兵、黄大亮、吴振兴、徐维加、郑秋月、徐君怡。犛 犖犜 贝类中失忆性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附法范围本标准规定了贝类及其制品中失忆性贝类毒素检验的酶联免疫吸附法。本标准适用于贝类及制品中失忆性贝
2、类毒素的检测。术语、定义和缩略语 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。失忆性贝类毒素犪 犿 狀 犲 狊 犻 犮 狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺狆 狅 犻 狊 狅 狀；犃 犛 犘化学结构以软骨藻酸为代表，摄食后可产生头晕目眩，定向力障碍及持续性短期记忆缺失等症状的存在于贝类体内的海洋生物毒性物质的总称，它是一类具有神经兴奋的氨基酸类物质。软骨藻酸犱 狅 犿 狅 犻 犮犪 犮 犻 犱；犇 犃主要由拟菱形藻属硅藻产生的一种谷氨酸和红藻酸的类似物，能够污染鱼贝类等海洋生物，是引起人类记忆缺失性中毒的致病因子。缩略语下列缩略语适用于本文件。（）：失忆性贝类毒素。（）：酶联免疫吸附试验。样品保存和制
3、备 样品的保存 样品要有充分的代表性并尽可能没有个体差异，且至少要 个以上。去壳贝肉、带壳的或罐装的等，均应采取足够的个数并使贝肉达 以上。远离实验室不能及时送检的样品，除了在常温下品质不会发生变化的，应将样品置于保温盒中冷冻送检。如为带壳样品，应按 的方法开壳，去除水分后冷冻送检。样品的制备 生鲜带壳样品的前处理用清水将贝壳外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用重蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取出贝肉，切勿割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集 贝肉置于筛子中沥水 （不要使肉堆积），检出碎壳等杂物，将贝肉均质，备用。犛 犖犜 冷冻样品的前处理在室温下
4、，使冷冻样品呈半冷冻状态。带壳冷冻样品，按 方法清洗、开壳、淋洗取肉，此时的贝肉仍呈冷冻状态，除去贝肉外部附着的冰片，轻轻抹去水分后；事先已去除水分的冷冻去壳样品，室温缓化。将 上述贝肉均质，备用。贝类罐头将罐头内容物沥干水分，倒入均质器充分均质，备用。贝肉干制品称取 干制品放入足量清水中浸泡 （冷藏），沥干、备用。盐渍品用清水洗涤，流水脱盐，沥干，备用。测定方法 测定原理本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应，酶标板上包被有针对软骨藻酸抗体的捕捉抗体，加入抗软骨藻酸抗体、标准液或样品溶液及软骨藻酸酶标记物，游离的失忆性贝类毒素与软骨藻酸酶标记物竞争软骨藻酸抗体，同时软骨藻酸抗体与捕捉抗体连接。
5、没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质和显色剂加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在 测量微孔溶液的吸光度值，样品中的失忆性贝类毒素溶液与吸光度值成反比，按绘制的标准曲线定量计算。试剂和材料除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯或生化试剂，水为重蒸馏水。无水甲醇。半对数坐标纸。标准物质。酶标记物。抗 抗体。包被有捕捉抗体的微孔板。基质（过氧化氢）发色剂（四甲基联苯胺）。洗脱液：吐温 。反应终止液：硫酸。商业化试剂盒如比利时 和挪威 公司生产的失忆性贝类毒素检测试剂盒），若测定低限和回收率达到本标准的要求则也适合于本标准。
6、）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。仪器和设备 酶标仪（）。犛 犖犜 均质器。离心机。微量加样器：，。微量多通道加样器：。天平（感量 ）。滤器。试样的提取称取第章均质的贝类组织 （精确至 ），加入 水，涡旋振荡 ，加入 甲醇，涡旋振荡 。犵离心 ，用 滤器过滤上清液，得到样品提取液。用稀释缓冲液将样品提取液稀释 倍（如吸取 样品与 稀释缓冲液混合）。取 按 方法进行酶联免疫测定。此时的稀释倍数是 。高浓度的样品，如超出标准曲线范围，可进一步用缓冲液稀释，直至样品浓度在标准曲线范围以内。酶联免疫测定将足够数量的已包
7、被捕捉抗体的微孔条插入微孔架（空白对照、标准液和样液分别做复孔），记录空白对照、标准液和样液的位置。向空白对照孔加入 稀释缓冲液，向标准液和样液孔分别加入相应的 个个失忆性贝类毒素标准液或样液到各自的微孔，每个标准液和样液应使用新的吸头。向上述所有的微孔中加入 酶标记物工作液，向除空白对照孔之外的所有微孔中加入 抗体工作液，迅速充分混合 ，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，孵育。孵育结束后，倒去孔中液体，每个微孔注入 洗液冲洗，翻转微孔板，倾去孔内液体，再重复以上洗板操作次，在吸水纸上拍干。每孔加 底物显色剂溶液，充分混合，室温避光孵育 。每孔加入 终止液迅速混匀后，在 内测量并记录 波长下的吸光
8、度值。结果的计算和表述 计算百分比吸光度值标准液和样液的平均吸光度值（值）减去空白对照孔的平均 值作为标准液和样液的平均校正 值。按式（）分别求得每个失忆性贝类毒素标准液和样液的百分比吸光度值：犃犛犛犛犛 （）式中：犃 百分比吸光度值；犛 失忆性贝类毒素标准液或样液的平均 值；犛 空白对照孔的平均 值；犛 的失忆性贝类毒素标准液的平均 值。绘制标准曲线以百分比吸光度值为纵坐标，以失忆性贝类毒素溶液浓度（）的对数值为横坐标，绘制标准曲线。每次试验均应重新绘制标准曲线。或通过软件计算出浓度与百分比吸光度值间的标准曲线公式，得到回归方程 见式（）：犢犃 犡犅（）式中：犢 百分比吸光度值；犛 犖犜 书
9、书书?失忆性贝类毒素浓度?单位为纳克每毫升?和?为根据标准液计算出的公式常数?结果的计算在?绘制的标准曲线上读取待测液百分比吸光度值所对应的失忆性贝类毒素浓度?即为待测液中失忆性贝类毒素的含量?为了获得样品中失忆性贝类毒素的实际浓度?从标准曲线上读出的浓度值应乘以相对应的稀释系数?或通过式?即可求出待测孔的?浓度?再乘以样品稀释倍数即为原始样品失忆性贝类毒素浓度?结果的表述?当测定值?时?则报告失忆性贝类毒素含量?当测定值?时?则报告实际测定数值?测定低限和回收率?测定低限本方法的测定低限为?回收率本方法的回收率为?健康和安全?任何失忆性贝类毒素含量值大于?的样品即被认为是有害的?对人类食用不安全?标准液含有失忆性贝类毒素?应特别小心?避免接触?甲醇对人体有害?建议有条件的实验室在通风橱中操作?反应终止液为?硫酸?避免接触皮肤?书号?定价?元