1、SN/T2039-2007前言本标谁由国家认证认可监督管理委员会提出并归山。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和闲广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨伟东、余道坚、胡学难、康林、陈枝楠、仲建忠、章挂明、徐浪。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T2039-2007地中海实蝇检疫鉴定方法PCR法1范围本标准规定了地中海实蝇常规PCR和SYBR Green实时类光IP(R鉴定方法.本标准适用于进境水果、茄科蔬菜（包括番抗茄子和辣椒签）及包装物、土裳等的检验检按小对地中海实蝇卵、幼虫、蛹和成虫的种类鉴定2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成
2、为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件.其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标雅，然而，鼓励根据标准达成协议的午方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于木标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验祛(neg IS()3696)3缩略语下列缩略语适用于本标准3.1SG-PCR SYBR green real-time-PCRSYBRGreen实时荧光PCR3.2dNTP deoxyribonucleoside triphosphate脱氧核苷三磷酸。3.3MCA melting curve analysis溶解曲线分析。3.4Tag
3、酶栖热水生菌DNA聚合酶。3.5COI cytochrome oxidasel细胞色紫氧化酶】亚基。3.6Ct threshold cycle循环调值。4原理实蝇样本（卵、幼虫、蛹或成虫）经过提取总基因组NA后，利用设计的特异性引物，通过常规(K和SYBR Green实时荧光PCR(SG-P(R)技术，特异性扩增地中海实蝇mtDNA(C(I基因片段(343bp),根据PCR扩增结果（常规P(R通过产物凝胶电冰结果；SG-PCR通过扩增曲线和溶解曲线），SN/T2039-2007判实：桃标水的种类是行是恺中海实：蝇。特异性川物地通过比对地海实蝇与階实蝇帼巾的纳塔尔实蝇、非洲芒果实蝇，按实蝇属中的
4、加勒比按实挑，西f按实抛，以及绝大多数果实蝇的mtDNA C(OI基因片段设计出来的。5仪器5.1(K增仪。5.2实时淡光1(R仪。5.3电冰仪5.4紫外分光光度计5.5凝胶成像系统.5.6低冰箱.5.7冷箴冷冻冰箱.5.8水浴锅.5.9离心机.5.10电了火平。5.11微t加样器(0.5ul、2l、10l、20L、100L、200ul、1000l)。6试剂6.1实验用水（应符介(3/T6682中一级水的规格）。6.2张1酶K(20ng/ml.)。6.3RNA化海6.41)TA(0.5nl/1p1H8.0).6.5T(118.0)。6.610Xl.alig3fer(电泳.上样级冲液)。6.7
5、Iadder DNA Marker6.8琼胎糖。6.9IDNA染色剂.6.10起虫内组I)NA提取试剂盒。6.11)NA快纯化/间收试剂盒.6.1270%和99.99%乙.6.13酚、三甲烷、异丙萨、异戊醇等有机试剂，有机试剂如未有特殊说明，均为分析醇。6.14P(R试剂盒C包括10XP(R级冲液、Mg(25mmol/1.)、dNTP(2.5mmol/L)。6.15Tag酶。6.16 2XSYBR Green Master Mix.6.17引物(10nol/l.)。7检测方法7.1实蝇标本的前处理用于分子生物学试验的实蝇样本使用前应长期冷藏在一4冰箱。所有实蝇标本在DNA提取之前均要作前处理.
6、卵、幼虫、蛹、成虫或部分组织等实蝇样本要用无菌水冲洗数遗，晾干：干标本、乙醉和福尔马林浸泡的标本光用TE(pH8.O)浸泡处理】h2h,SN/T2039-20077.2实蝇基因组DNA提取7.2.1试剂盒法将实蝇样本移入1.5mL离心管或碾钵中，捣碎或加人液氨碾磨，之后实验步骤根据试剂盒的操作说明书操作。实蝇基因组DNA溶液置一20冷冻保存。7.2.2酚-三氨甲烷法将单头实蝇样本移入1.5mL离心管或碾钵中.捣碎或加人液缸限磨。加人DNA裂解级冲液300uL和蛋白酶K20L(200g/mL),65水浴1h3h或过夜：加等休积的0：三风甲烷：异戊醇(25:24:1),轻轻颠倒混匀2次，8000r
7、/mimn离心5min.小心吸取上清液：加人等体积的三氣甲烷-异戊醇(24：1)，混匀，8000r/min离心5min.小心吸取上清液：承复此步骤1次2次.直到在界而上看不到蛋白质；加入2倍体积的无水乙醇或异丙醇，混匀.室温或一20沉淀0.53（也可沉淀过夜），13000r/min离心5min30min,弃上清液；70%或75%的乙醇洗涤沉淀2次3次，8000r/min适度离心2mi,弃上清液：沉淀干燥后加人50uL200uLTE或去离子水溶解，一20低温保存。7.3DNA质量检查实蝇基因组DNA的纯度和浓度检测方法通过紫外分光光度计测定DNA溶液的()D值，IDNA纯度=OD2so/OD2(
8、1.6ODo/OD2.0，比值低于1.6或高于2.0都认为模板纯度不够，前者不能满足PCR扩增时对模板的纯度要求，需用DNA快速纯化/回收试剂盒纯化；后者模板中含有RNA,必要时要用RNA酶消化)：双链DNA浓度=OD2XDNA母液稀释倍数X50ng/L。7.4常规PCR扩增反应7.4.1引物地中海实蝇常规PR扩增引物序列见表1。表1引物序列类型名称序列广增片段长度甲正向引物CCCA-COI-L5-TCTTCACGATACTTATTATGTTGTT-3343反向引物CCCA-COI-R5-ACTTGACGTTGAGAAACAAGG-37.4.2反应体系反应体系见表2。表2常规PCR反应体系试剂名称P(K反应体系终浓度10PCR缓冲液（不含Mg2+)1P(R级神液MgCl,溶液2 mmol/LdNTP0.2mmol/1.正向引物和反向引物各0.2zmwl/LTaq碑IUDNA模板20ng40n啡双蒸水补足反应总休积到25.注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总休积进行适当调散。3