1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3027一2011出口蜂王浆中氟喹诺酮类残留量测定方法酶联免疫法Determination of fluoroquinolones residues in royal jelly for export-Enzyme-linked immunosorbent assay2011-09-09发布2012-04-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布SN/T3027-2011前言本标准依照GB/T1.1一2009的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张
2、晓峰、朱振江、吴姗、帅江冰、陈笑梅。SN/T3027-2011出口蜂王浆中氟喹诺酮类残留量测定方法酶联免疫法1范围本标准规定了蜂王浆中氟喹诺酮类残留量的酶联免度测定方法本标准适用于蜂王浆中那氟沙量、芦氟沙星、达氟沙星、恩诺沙星、盐酸环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、二氟沙星、沙拉沙星和依诺沙星残留总量的则定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其量新版本（包括所有的修改单）适用舌本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理以高氯酸来沉淀蜂王浆的蛋白，并提取蜂王浆残留的氟喹
3、诺国类药物。微孔板中包被有诺氟沙星抗体，加入结合辣根过氧化酶的清氟沙星酶标记诺氟沙星)、诺氟沙星标准品或样品提取液后，标准溶液中的诺氟沙星或样品中的氟唯诺酮类和酶标记诺氟沙星竟争性地与诺氟沙星抗体结合。通过洗涤除去未结合的试剂，然后加入底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中氟喹诺酮类的含量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB个6682规定的一级水。4.1 Randox氟喹诺酮类检测试剂盒”。4.2诺氟沙星酶标记物溶液：根据氟喹诺酮类试剂盒中说明，用酶标记物稀释液（参见附录A)将诺氟沙星酶标记物浓缩液（参见附录A)溶解，混匀后备用。4.3稀释洗涤缓冲液：根据氟喹
4、诺酮类试剂盒中说明，将稀释洗涤缓冲液浓缩液（参见附录A)加970mL水稀释，混匀后备用。4.4磷酸：分析纯。4.5NaC1:分析纯。4.6甲醇：分析纯。4.730%氢氧化钠：30 g NaOH溶于水中，用水定容至100mL。4.86%高氯酸：取6mL高氯酸用水定容到100mL.1)给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。1SN/T3027一20114.910%甲醇：10mL甲醇(4.6)用蒸馏水定容至100mL。4.10HLB固相萃取小柱：Oasis,3mL(60mg),Waters。4.11诺氟沙星标准物质：纯
5、度98%。4.12诺氟沙星标准品溶液：用乙腈作为溶剂配制成100ng/mL的储存液，于一20条件下保存。4.13空白样品：选用已确切知道不含有氟喹诺酮类抗生素的蜂王浆样品，作为空白样品，用于随样测试的加标监控实验。5仪器5.1酶标仪。5.28道移液器：10L100uL。5.3单道移液器：10L100uL,100L1000L和2mL10mL。5.4混合振荡器。5.5高速冷冻离心机：6000r/min。5.6固相萃取装置。5.7氮吹仪。5.8具塞试管：50mL。5.9电子天平：0.01g100g。6试样的制备与保存6.1试样的制备原始样品总量不得少于500g,采用四分法，将样品分成两等份装入洁净容
6、器，加封并做标识。6.2试样的保存将样品于一20一18条件下保存。7分析步骤7.1提取称取2g蜂王浆样品，精确到0.1g,置于50mL具塞试管中，加入8mL6%高氯酸(4.8)，充分混匀，15条件6000r/min离心10min直至清亮，取5mL上清液于一干净试管，加入0.5 g NaCl(4.5),混匀后3000r/min离心5min,取3mL上清液于一干净试管，用30%氢氧化钠(4.7)或磷酸(4.4)调pH至4,08.0。HLB小柱(4.10)先依次用1mL甲醇(4.6)和1mL蒸馏水活化，吸取2.5mL试样溶液过柱，3mL水洗，1mL10%甲醇(4.9)洗柱，用负压去除残留的液体，并且
7、在弱空气或氮气吹2min干燥柱子。用2mL甲醇(4.6)洗脱，将样品收集于一干净试管，氨气吹干，以1mL稀释洗涤缓冲液(4.3)溶解残留物，调节pH至7.0，供ELISA检测用，最后稀释倍数为2。7.2测定条件7.2.1操作温度：以下所有操作应在20一24下进行。7.2.2酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450nm。7.2.3洗板条件：人工洗涤次数5次以上，自动洗板可以预定5次周期，每次注水量为200L。2SN/T3027-20117.3测定步骤7.3.1测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。7.3.2氟喹诺酮类试剂盒回升至室温后，将测定需用的微孔板备齐并插人微孔架上，记录标准及样品等在
8、微孔架上的位置。7.3.3吸取50uL诺氟沙星标准溶液（浓度分别为：0ng/mL、0.125ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、12.5ng/mL)于孔A1、A2F1、F2;吸取50uL样品溶液于其余微孔中。7.3.4吸取75uL诺氟沙星酶标记物溶液(4.2)于每一个微孔。7.3.5用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀。7.3.6将酶标板置于室温避光孵育1h。7.3.7倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打。以除去孔中多余的残液，但不能使微孔干燥。然后，立即用洗涤缓冲液(4.3)按7.2.3要求进行洗板。手工洗板时，每次洗板均应将微孔架反扣在吸
9、水纸上反复拍打，以除去孔中多余的残液，但不能使微孔干燥。7.3.8迅速加人100L底物显色剂（参见附录A)于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于2024避光孵育20min。7.3.9迅速加入1004L反应停止液（参见附录A)于每一个微孔底部。然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在450m处测量吸光度OD值（加入反应停止液后应在30min内读取吸光度)。7.4平行试验按以上步骤，对同一标准溶液的系列、同一样品溶液均应进行双孔平行测定。7.5空白试验除不称取试样外，均按分析步骤进行。7.6质控试验每次测定均应做一个用空白样品添加诺氟沙星标准溶
10、液(4,12)的质控样品测定，以确定试验过程的准确性。8结果计算标准品和待测样品的OD平均值除以零标准(A1、A2)的平均OD值，再乘以100。计算出各标准液和样品的百分比吸光度值。零标准为100%（最大百分比吸光度值），其他OD值为最大吸光度值的百分数。以吸光度百分比值为纵坐标(%)，诺氟沙星标准溶液浓度(g/mL)对数值为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的氟喹诺酮类浓度后，结果按式(1)进行计算：X=cXVX1000(1）m1000式中：X一样品中氟喹诺酮类的残留量，单位为微克每千克(g/kg):c一从标准工作曲线上得到的样品中诺氟沙星浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL):V一一样品溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；m一样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克(g)。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。所得结果保留至一位小数。3