1、ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB 37/T 38212019鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范Diagnostic techniques for novel duck reovirus disease2019 - 12 - 24发布2020 - 01 - 24实施山东省市场监督管理局发布DB37/T 38212019前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所。本标准主要起草人：于可响、宋敏训、李玉峰、马秀丽、刘存霞、姜亦飞、胡峰、亓丽红、黄兵、
2、郭效珍、刘玉山。10鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范1 范围本标准规定了鸭新型呼肠孤病毒病的临床诊断、实验室诊断和综合判定技术规范。本标准适用于鸭新型呼肠孤病毒病的诊断和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鸭新型呼肠孤病毒病又称“肉鸭脾坏死症”、“番鸭出血性坏死性
3、肝炎”，是由鸭新型呼肠孤病毒引起的多品种雏鸭脾脏出血和坏死为主要特征的疾病。该病毒在血清学和基因序列上与原有的番鸭呼肠孤病毒有明显差异。4 临床诊断4.1 流行病学该病一年四季均可发生，不同品种的鸭均可发病，如樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭等；发病日龄一般为525日龄，其中以510日龄居多，病程57天。4.2 临床症状病鸭精神沉郁，发育不良，部分拉白色稀粪，一般不会出现神经症状，容易继发鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌等细菌感染。发病率5 %35 %，死亡率20 %以下。4.3 病理变化脾脏表面出血或坏死是其主要病变特征。4.4 结果判定符合4.1流行病学特征，病鸭出现4.2临床症状和4.3病理变化，可
4、判为鸭新型呼肠孤病毒病疑似病例，应进行实验室确诊。5 实验室诊断除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T 6682二级水的规定；实验室生物安全要求按照GB 19489执行。5.1 病原分离鉴定5.1.1 仪器和设备5.1.1.1 高速冷冻离心机。5.1.1.2 恒温培养箱。5.1.2 试剂或材料5.1.2.1 青链霉素（青霉素10 000 IU/mL，链霉素10 000 g/mL）。5.1.2.2 0.22 m微孔滤器。5.1.2.3 8日龄9日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚。5.1.3 病料处理按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏1 g2 g，加入10倍体积
5、生理盐水和终浓度2 000 IU/mL的青链霉素，剪碎后充分研磨，反复冻融2次3次，8 000g离心20 min，取上清液用0.22 m微孔滤器过滤，经菌检无菌后用于病原分离。5.1.4 操作步骤5.1.4.1 取5.1.3中处理好的上清液经尿囊腔接种8日龄9日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚，0.1 mL/枚，共5枚。封口后置于37 恒温箱继续孵化，每日照胚两次，记录鸭胚死亡情况，观察到第6天。5.1.4.2 弃掉接种后24 h内死亡的鸭胚，若接种6天内鸭胚出现死亡，则收集死亡鸭胚的尿囊液，用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法进行鉴定；若接种6天内鸭胚不出现死亡，则收集6天活胚的尿囊液，用
6、5.2、5.3、5.4中的任意一种方法进行鉴定。5.1.5 结果判定5.1.5.1 阳性：接种后死亡鸭胚或接种后6天活胚的尿囊液用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法检测为阳性。5.1.5.2 阴性：接种后死亡鸭胚或接种后6天活胚的尿囊液用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法检测为阴性。5.2 RT-PCR方法5.2.1 仪器和设备5.2.1.1 高速冷冻离心机。5.2.1.2 PCR扩增仪。5.2.1.3 电泳仪。5.2.1.4 紫外分析仪。5.2.2 试剂或材料5.2.2.1 TRIZol。5.2.2.2 无RNA酶水。5.2.2.3 反转录酶M-MLV。5.2.2.4 RNA酶抑制剂
7、。5.2.2.5 Taq酶。5.2.2.6 琼脂糖。5.2.2.7 Goldview DNA染料。5.2.2.8 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。5.2.2.9 阴性参照物（阴性尿囊液）。5.2.3 操作步骤5.2.3.1 样品处理按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏1 g2 g，加入10倍体积生理盐水，用剪刀剪碎后，置于研磨器中充分研磨，反复冻融2次3次，8 000g离心10 min，取上清液100 L用于RNA提取。5.2.3.2 RNA提取5.2.3.2.1 在100 L病料上清液中加入1 mL TRIZol，剧烈颠倒50次100次，室温静置10 min后，加入200 L氯仿，上下
8、颠倒50次100次，室温静置5 min10 min，12 000g离心10 min。5.2.3.2.2 吸取上清加入等体积氯仿，上下颠倒50次100次，12 000g离心10 min。5.2.3.2.3 吸取上清加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后，-20 静置至少30 min，然后12 000g离心15 min20 min。5.2.3.2.4 弃上清液，加入1 mL 75 %酒精，12 000g离心5 min10 min。5.2.3.2.5 弃上清液，倒置自然晾干，或12 000g再离心5 min，吸掉管底部的液体。5.2.3.2.6 沉淀用20 L无RNA酶水溶解，备用。阳性和阴性参照物RNA的
9、提取同上。样品RNA提取也可使用同等效果的商品化试剂盒。5.2.3.3 引物上游引物P1：5 TCATTCATTTGGGCAGCGG 3下游引物P2：5 AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT 35.2.3.4 RT-PCR扩增5.2.3.4.1 反转录（RT）反应反应体系为10 L。在PCR管中加入dNTP(10 mmol/L) 0.8 L，引物P1(20 mol/L) 0.5 L，引物P2(20 mol/L) 0.5 L，RNA 5.0 L，放PCR仪中70 作用5 min，然后取出冰浴1 min2 min，再加入RNA酶抑制剂(40 U/L) 0.5 L，反转录酶M-MLV(200
10、 U/L) 0.7 L，5M-MLV buffer 2 L，继续放PCR仪中42 30 min，95 2 min。5.2.3.4.2 PCR扩增5.2.3.4.2.1 反应体系反应体系为50 L，配制见表1。表1 PCR反应体系配制反应体系中各成分每个样品反应组分用量/L10PCR buffer4.520 mol/L引物P10.520 mol/L引物P20.5RT产物5.05 U/L Taq E0.5ddH2O39.0总体积50.05.2.3.4.2.2 反应程序采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段：95 3 min； 第二阶段：95 20 s，55 20s，72 30 s，共进行30个循环；
11、 第三阶段：72 10 min。RT-PCR扩增也可使用商品化的RT-PCR试剂盒，按说明书要求操作。5.2.3.5 电泳取PCR扩增产物6 L与10上样缓冲液1 L混合，加入到1.5 %的琼脂糖凝胶孔中，同时在旁边点样孔中加入2 000 bp Ladder Marker（分子量标准物）10 L，以5 V/cm电压进行电泳25 min30 min，在紫外分析仪上观察结果。5.2.4 结果判定5.2.4.1 试验成立条件在阳性对照出现一条大小226 bp的单一条带，同时阴性对照无此条带的情况下，检测结果成立。5.2.4.2 结果判定被检样品出现与阳性对照同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现
12、与阳性对照同样大小的条带时，判为阴性。参见附录A。5.3 荧光RT-PCR方法5.3.1 仪器与设备5.3.1.1 高速冷冻离心机。5.3.1.2 荧光定量PCR扩增仪。5.3.2 试剂或材料5.3.2.1 TRIZol。5.3.2.2 无RNA酶水。5.3.2.3 SYBR Green荧光RT-PCR反应液（2SYBR Premix）。5.3.2.4 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。5.3.2.5 阴性参照物（阴性尿囊液）。5.3.3 操作步骤5.3.3.1 样品处理参见5.2.3.1。5.3.3.2 RNA提取参见5.2.3.2。5.3.3.3 引物上游引物P3：5 ATCGCACTATT
13、GACGCACTT 3下游引物P4：5 TTGACGACGCCAATCCC 35.3.3.4 荧光RT-PCR扩增5.3.3.4.1 反转录（RT）反应 参见5.2.3.4.1。5.3.3.4.2 荧光PCR5.3.3.4.2.1 反应体系反应体系为25.0 L，配制见表2。表2 荧光PCR反应体系配制反应体系中各成分每个样品反应组分用量/L2SYBR Premix12.520 mol/L引物P30.520 mol/L引物P40.5RT产物1.0ddH2O10.5总体积25.05.3.3.4.2.2 反应程序采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段：95 45 s； 第二阶段：95 10 s，56
14、 10 s，72 15 s，40个循环，每次循环在72 延伸时收集荧光。荧光RT-PCR扩增也可使用商品化的Real-time RT-PCR试剂盒，按说明书操作。反应结束后根据分析软件得出的Ct值和扩增曲线来判定结果。5.3.4 结果判定5.3.4.1 试验成立条件在阳性对照的Ct值33且出现典型扩增曲线，阴性对照Ct值35的情况下，试验成立。5.3.4.2 结果判定当被检样品Ct值33且出现典型扩增曲线时，判为阳性；当被检样品无Ct值或者Ct值35时，判为阴性；当被检样品Ct值在33-35之间时判为可疑，需重做，再次检测结果的Ct值35，且出现典型扩增曲线，则判为阳性，否则判为阴性。参见附录B。5.4 RT-LAMP方法5.4.1 仪器与设备5.4.1.1 高速冷冻离心机。5.4.1.2 水浴锅。5.4.1.3 紫外分析仪。5.4.2 试剂或材料5.4.2.1 TRIZol。5.4.2.2 无RNA酶水。5.4.2.3 甜菜碱（betaine）。5.4.2.4 TritonX-100。5.4.2.5 反转录酶AMV。5.4.2.6 RNA