1、ICS13.060C 51DB37山东省地方标准DB37/T 41562020水质放线菌的测定涂布平板法Water qualityDetermination of actinomycetesPlate coating method2020 - 09 - 25发布2020 - 10 - 25实施山东省市场监督管理局发布DB37/T 41562020目次前言II1范围12规范性引用文件13方法原理14试剂和材料15仪器和设备26样品27分析步骤38结果计算与报告39精密度410质量保证和质量控制411废物处理4附录A（资料性附录）常见放线菌图片5前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草
2、。本标准由山东省住房和城乡建设厅提出并组织实施。本标准由山东省城镇给水排水标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省城市供排水水质监测中心、潍坊市公用事业产品服务质量监测中心、国家城市供水水质监测网福州监测站、国家城市供水水质监测网武汉监测站、泰安市自来水有限公司水质检测中心、威海市水务水质检测中心有限公司。本标准主要起草人：逯南南、贾瑞宝、孙韶华、赵清华、褚福敏、石近淼、田立平、朱光进、张颖、孙婷婷、陶妍、王涛、逯凯、肖润泽、兰榕星、邢峰杰。5水质放线菌的测定涂布平板法1 范围本标准规定了测定水中放线菌的涂布平板法。本标准适用于生活饮用水及其水源水中放线菌的测定。处理水样为1L时，本方法的
3、检测限为1CFU/L。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 5750.22006生活饮用水标准检验方法水样的采集与保存GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3 方法原理放线菌是一类革兰氏染色阳性、具有菌丝、菌丝直径为0.5m0.8m的原核细胞型微生物，属于细菌范畴。用孔径为0.2m的聚碳酸酯膜过滤水样，对水中的放线菌进行浓缩富集，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗脱截留在膜上的放线菌，将洗脱液涂布于选择性培养基上，经281培养7d后，计数平板上生
4、长的典型放线菌菌落。4 试剂和材料4.1 重铬酸钾，纯度98%。4.2 硫代硫酸钠，纯度98%。4.3 硫代硫酸钠溶液：称取0.5g硫代硫酸钠（4.2），精确至0.1g，溶于适量水中，定容至100mL，121高压灭菌20min，备用。4.4 革兰氏染色试剂盒（市售）。4.5 无菌水：实验用水，水质满足GB/T 6682二级及以上分析实验室用水要求，经121高压蒸汽灭菌20min，备用。4.6 高氏一号培养基：每1L培养基中其成分及含量如下：淀粉 20g琼脂 20g硫酸亚铁 0.01g硫酸镁 0.5g磷酸氢二钾 0.5g氯化钠 0.5g硝酸钾 1g纯水 1000mL将上述成分混合后，加热溶解，加
5、入0.1g重铬酸钾（4.1），混匀后分装，121高压灭菌20min。临用时加热融化琼脂，冷却至5055，倾注平皿，冷凝备用。也可以采用市售商品化培养基制品。4.7 磷酸盐缓冲液：氯化钠 8.01g氯化钾 0.2g 磷酸氢二钠 1.44g磷酸二氢钾 0.24g上述成分溶解于950mL的无菌水（4.5）中，用盐酸调节溶液pH值到7.4后加纯水定容至1000mL，121高压灭菌20min，备用。4.8 聚碳酸酯滤膜：孔径0.2m，直径47mm；121高压灭菌20min。4.9 链霉菌标准菌株，有证标准菌株。4.10 大肠埃希氏菌标准菌株，有证标准菌株。5 仪器和设备5.1 恒温培养箱：允许温度偏差2
6、81。5.2 高压蒸汽灭菌器：121可调。5.3 真空抽滤装置。5.4 显微镜：配备10倍目镜，10倍、40倍物镜。5.5 电子天平：精确至0.001g。5.6 移液枪：0L200L。5.7 漩涡振荡器。5.8 镊子。5.9 离心管：15mL和1.5mL。6 样品6.1 样品采集与保存使用灭菌处理的玻璃瓶（也可选用有效期内市售无菌采样瓶和采样袋）采集水样，采样量不少于1L。加入硫代硫酸钠溶液（4.3）去除残留余氯（每125mL容积加入20L硫代硫酸钠溶液，水源水放线菌测定忽略此步），样品采集与保存按照GB/T 5750.22006中微生物指标要求执行。6.2 样品富集用无菌镊子（5.8）夹取滤
7、膜（4.8）的边缘部分，贴放在灭菌的滤床上，稳妥的固定好真空抽滤装置（5.3）。将1L水样注入滤器中，打开真空泵抽滤。注： 针对富集困难的样品，抽滤过程中可以更换滤膜（23张），或者适当减少抽滤体积。6.3 洗脱抽滤完毕，取下滤膜放到已灭菌的15mL离心管（5.9）中，加入5mL磷酸盐缓冲液（4.7）后，漩涡振荡器（5.7）上充分振荡5min，使放线菌从膜上完全解离下来，得到浓缩液，待测。7 分析步骤7.1 梯度稀释吸取100L浓缩液（6.3）加入到盛有900L磷酸盐缓冲液（4.7）的1.5mL离心管（5.9）中，充分混匀配制成1:10的稀释液；吸取1:10的稀释液100L加入到盛有900L磷
8、酸盐缓冲液（4.7）的1.5mL离心管（5.9）中，充分混匀配制成1:100的稀释液；按同样方法稀释成1:1000的稀释液备用。7.2 涂布平板分别取浓缩液原液、1:10的稀释液、1:100的稀释液、1:1000的稀释液100L，用无菌涂布器均匀涂布于高氏一号平板上，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。所有稀释度均需设置平行。7.3 培养将涂布好的平板放到隔水式恒温培养箱（5.1）中281倒置培养7d。7.4 染色与镜检7.4.1 采用革兰氏染色试剂盒（4.4）对平板上生长的典型菌落进行革兰氏染色，并在显微镜（5.4）下对革兰氏阳性菌株进行菌丝体确认。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态
9、特征是放线菌分类鉴定的重要依据。7.4.2 典型菌落通常具有以下特征，满足其一即可认定为典型菌落：a) 圆形、光滑或表面褶皱；b) 絮状、粉状或颗粒状；c) 菌落和培养基结合较紧密，菌落质地致密。7.5 计数根据染色结果对放线菌菌落进行计数。8 结果计算与报告8.1 稀释度的选择8.1.1 选取放线菌菌落数在30300之间的平板计算菌落数，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围，则将该稀释度计数值按照公式计算报出结果。8.1.2 若有两个稀释度，其菌落数均在30300之间，则视两者之比值来决定，若其比值小于2，则取两者的平均数按照公式计算报出结果；若大于或等于2，则取其中稀释度较小的平均菌落数
10、按照公式计算报出结果。8.1.3 若所有稀释度的菌落数均大于300，则取稀释度最高的平均菌落数值按照公式计算报出结果。8.1.4 若所有稀释度的菌落数均小于30，则取稀释度最低的平均菌落数值按照公式计算报出结果。8.1.5 若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以“未检出”报告。8.2 结果计算根据鉴定结果，按照公式（1）计算放线菌菌落数，以每1L水样中的放线菌菌落数报告。(1)式中：M 鉴定出的放线菌菌落数，CFU；N 浓缩液的稀释倍数；V 过滤水样体积，L；V1 浓缩液体积，mL；V2 涂板体积，mL。8.3 结果报告测定结果保留两位有效数字。当测定结果100CFU/L时，以科学计数法表示；
11、当测定结果低于检测限时，则报“未检出”。9 精密度6家实验室对放线菌浓度20CFU/L的样品定性结果一致，对浓度为（2010）CFU/L、（200100） CFU/L的两个样品7次重复测定，相对标准偏差分别为3.2%14.6%和0.8%8.5%。注： 微生物检测数据为偏态分布，其测定结果全部以10取对数后进行计算。10 质量保证和质量控制10.1 空白对照每批样品进行空白对照测定，选用无菌水（4.5）按照6.26.3、7.27.5步骤进行空白对照测定。10.2 阳性对照和阴性对照定期使用链霉菌标准菌株（4.9）和大肠埃希氏菌标准菌株（4.10）作为阳性和阴性对照菌株，对检测质量进行控制。将标准菌株制备成菌浓度10CFU/L的菌悬液，按照6.26.3、7.27.5步骤进行分析测定，阳性菌株呈阳性反应，阴性菌株呈阴性反应。10.3 干扰和消除放线菌检测的过程中，需在选择性培养基中加入重铬酸钾抑制其他细菌的生长，重铬酸钾的加入量约为100mg/L。10.4 培养基质控对每批次培养基须选用标准菌株进行培养基质量检验。11 废物处理实验中产生的废物经高压蒸汽灭菌器（5.2）121灭菌20min后，作为一般废物处理。AA附录A （资料性附录）常见放线菌图片 表A.1 放线菌菌落 表A.2 放线菌镜检图片_