1、附件辣椒制品中苏丹红I的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201801）1 范围本方法规定了辣椒制品中苏丹红I的胶体金免疫层析快速检测方法。本方法适用于辣椒酱、辣椒油、辣椒粉等辣椒制品中苏丹红I的快速测定。2 原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苏丹红I与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中苏丹红I进行定性判定。3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。3.1 试剂3.1.1 乙腈。3.1.2 无水硫酸镁。3.1.3 正己烷。3.1
2、.4 二氯甲烷。3.1.5 氢氧化钠。3.1.6 氢氧化钠溶液（2mol/L）：称取氢氧化钠（3.1.5）8g，用水溶解并稀释至100mL。3.1.7 无水乙醇。3.1.8 复溶液：将无水乙醇（3.1.7）与水按照体积比25:75混匀。3.2 参考物质3.2.1 苏丹红I参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度95%。表1 苏丹红I参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量苏丹红ISudan I842-07-9C16H12N2O248.28注：或等同可溯源物质。3.3 标准溶液的配制3.3.1 苏
3、丹红I标准储备液（1mg/mL）：精密称取苏丹红I标准品（3.2.1）适量，置于10mL容量瓶中，加入适量乙腈（3.1.1）超声溶解后，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL的苏丹红标准储备液。-20 避光保存，有效期6个月。3.3.2 苏丹红I标准中间液（1g/mL）：精密量取苏丹红I标准储备液（1mg/mL）（3.3.1）100L，置于100mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1g/mL的苏丹红I标准中间液。3.4 材料3.4.1 固相萃取柱：CNW Poly-sery MIP-SDR固相萃取柱（200mg/3mL），或相当者。3.4.2 苏丹红I胶体金免
4、疫层析试剂盒，适用基质为辣椒酱、辣椒油、辣椒粉。3.4.2.1 金标微孔。3.4.2.2 试纸条或检测卡。4 仪器和设备4.1 移液器：200L、1mL和5mL。4.2 涡旋混合器。4.3 离心机：转速4000r/min。4.4 电子天平：感量为0.01g。4.5 氮吹仪。4.6 水浴锅。4.7 环境条件：温度1535，湿度80%。5 分析步骤5.1 试样制备取适量样品，液体样品或半固体样品充分混匀，固体样品充分粉碎混匀。5.2 试样的提取5.2.1 辣椒酱称取辣椒酱2g（精确至0.01g）于15mL离心管中，加入0.5g无水硫酸镁（3.1.2）和5mL正己烷（3.1.3）提取液，涡旋振荡1m
5、in后，4000r/min离心5min。将上清液全部加入到固相萃取柱（3.4.1）中，流出液弃去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱，流出液弃去。用2mL二氯甲烷（3.1.4）洗脱固相萃取柱，收集洗脱液吹干。精密加入400L复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。5.2.2 辣椒油称取辣椒油5g（精确至0.01g）于15mL离心管中，加入8mL正己烷（3.1.3）进行提取，涡旋振荡1min后，将上清液全部加入到固相萃取柱中，流出液弃去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱，流出液弃去。用2mL二氯甲烷（3.1.4）洗脱固相萃取柱，收集洗脱液吹干。精密加入400L复溶液（3.1.
6、8），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。5.2.3 辣椒粉称取辣椒粉3g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入8mL乙腈（3.1.1）提取，涡旋振荡1min后，6000r/min离心5min。转移上清液于10mL离心管中，吹干后加入2mL氢氧化钠溶液（3.1.6），涡旋混匀30s后置于80水浴皂化5min。再加入2mL正己烷（3.1.3），涡旋萃取30s后，6000r/min离心5min，转移上清液于新的10mL离心管中，加入无水硫酸镁（3.1.2）0.5g，涡旋振荡30s后，4000r/min离心5min，转移上清液于10mL离心管中吹干。精密加入400L复溶液（3.1.8），涡
7、旋混合1min，作为待测液，立即测定。5.3 测定步骤5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤吸取200L待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸510次使混合均匀，室温温育35min，将试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育58min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。5.3.2 检测卡与金标微孔测定步骤吸取200L待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸510次使混合均匀，室温温育35min，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，温育58min，进行结果判定。5.4 质控试验每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。5.4.1 空白试验称取
8、空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。5.4.2 加标质控试验准确称取空白试样（精确至0.01g）置于具塞离心管中，加入一定体积的苏丹红I标准中间液（3.3.2），使苏丹红I添加浓度为10g/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。6 结果判定通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图1。6.1 无效控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。6.2 阴性检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中苏丹红I低于方法检测限，判定为阴性。6.3 阳性检测线（T线）不显色或检测线（
9、T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中苏丹红I的含量高于方法检测限，判定为阳性。6.4 质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。a) 试纸条b) 检测卡图1 目视判定示意图7 结论当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。8 性能指标8.1 检测限：辣椒酱、辣椒油、辣椒粉的检测限为10g/kg。8.2 灵敏度：灵敏度应99%8.3 特异性：特异性应85%。8.4 假阴性率：假阴性率应1%。8.5 假阳性率：假阳性率应15%。注：性能指标计算方法见附录A。9 其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替
10、代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。本方法参比标准为标准为GB/T 19681-2005食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法。附录A定性方法性能计算表表A.1 性能指标计算方法样品情况a检测结果b总数阳性阴性阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异(2)c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.特异性（p-，%）p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）p
11、f-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法负责起草单位：南京工业大学。验证单位：山东省食品药品检验研究院、中国农业科学院油料作物研究所。主要起草人：熊晓辉，汪开银，卢一辰，王骏，王督。6