1、 ICS 65.020 CCS B 05 22 吉林省地方标准 DB22/T 33572022 玉米抗镰孢根腐病鉴定技术规范 Technical specification on evaluation of maize resistance to Fusarium root rot 2022-01-28 发布 2022-02-28 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 33572022 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉
2、林省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：吉林省农业科学院。本文件主要起草人：苏前富、贾娇、张伟、孟玲敏、白雪、王巍巍、高月波、王义生、晋齐鸣。DB22/T 33572022 1 玉米抗镰孢根腐病鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了玉米抗镰孢根腐病鉴定技术方法和抗性评价标准。本标准适用于栽培玉米（Zea mays L.）自交系和杂交种等种质资源对玉米镰孢根腐病抗性的人工接种鉴定及评价。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。镰孢根腐病 Fusarium root rot 由镰孢属的一些种（Fusarium spp.，有性态为赤霉属 Gibber
3、ella spp.）所引起的玉米苗期根部病害。4 镰孢菌接种体 分离、鉴定和保存 以常规组织分离法和单孢分离法（见附录 A）从田间采集的具有典型玉米根腐病症状的根部分离获得纯培养物，依据形态特征和分子鉴定结果，明确其镰孢属种级分类地位（见附录 B），4 保存备用。制备 挑取 4.1 保存的镰孢菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基 25 暗培养 5 d7 d 后，用无菌打孔器打取菌落边缘直径 5 mm 的菌饼，将其接种于合成低营养（SN）培养基中 150 r/min 摇培 7 d10 d，镜检分生孢子浓度达到 1106 个/mL 后，充分摇匀接种于经高压灭菌的高粱粒上，每 120 g 高粱粒
4、接种 1 mL 孢子悬浮液，充分混匀，25 培养 7 d10 d 后，待菌丝布满高粱粒，阴干低温保存备用。PDA、SN 和高粱粒培养基配方见附录 C。5 鉴定圃 设置 鉴定圃应具备良好的自然发病环境和排灌设施，周边应设置保护行。鉴定圃确定后不应随意更换。DB22/T 33572022 2 试验设计 鉴定圃中每 2 行(行长 5 m，行距 0.6 m0.7 m)为一个小区，随机排列或顺序排列。每 30 行50 行鉴定材料设 1 组对照材料（高抗自交系吉 842、高感自交系 LN 810），见附录 D。种植要求 根据鉴定材料生育期、土壤环境及气候条件等适当早播。每行播种 50 粒种子，精量点播。鉴
5、定材料出苗率低于 60%时视为该材料鉴定无效。6 接种 时期与方法 播种时将按 4.2 制备的接种体与种子同时施入播种穴中，每穴约 5 g 接种体。田间管理 播种后镇压保墒，正常田间管理。播种后若遇持续干旱，应及时浇灌，保持土壤含水量 60%70%。7 调查 时间 玉米 4 叶6 叶 期进行调查，同批次接种材料应在同一天完成。方法 全小区调查，以玉米主胚根 2/3 以上发生腐烂为发病植株。记录每份鉴定材料的总株数和发病株数,计算发病株率。按公式（1）计算发病株率：P=100 （1）式中：P发病株率，单位为百分率（%）；n发病株数，单位为株；N调查总株数，单位为株。病情分级 病情分级及相对应的植
6、株发病株率描述见表 1。表1 玉米对镰孢根腐病抗性鉴定的病情级别划分 病情级别 描 述 1 发病株率 0%10%；3 发病株率 10.1%20%；5 发病株率 20.1%40.0%；DB22/T 33572022 3 表1 玉米对镰孢根腐病抗性鉴定的病情级别划分（续）病情级别 描 述 7 发病株率 40.1%60.0%；9 发病株率 60.1%100%。8 抗性评价 有效性判别 当鉴定圃中高感对照材料达到表 1 中的 9 级，该批次材料苗期根腐病鉴定结果视为有效。评价 8.2.1 依据鉴定材料发病程度（病情级别）确定其抗性水平，评价标准见表 2。表2 玉米对镰孢根腐病抗性的评价标准 病情级别
7、抗 性 1 高抗 Highly resistant（HR）3 抗 Resistant（R）5 中抗 Moderately resistant（MR）7 感 Susceptible（S）9 高感 Highly susceptible（HS）8.2.2 对材料抗病性进行鉴定，鉴定结果填入表 3。表3 年玉米抗镰孢根腐病鉴定记录表 编 号 品种/种质名称 来 源 病情级别 发病株率（%）抗性评价 鉴定地点：接种镰孢菌分离物编号：接种日期：调查日期：评价技术负责人（签字）：年 月 日 DB22/T 33572022 4 重复鉴定 鉴定材料若初次鉴定表现为高抗、抗、中抗，翌年进行重复鉴定。评价结论 综合
8、两年评价结果，抗性以记载的最高病情级别为准，并依此结果对鉴定材料进行评价，形成评价结论。DB22/T 33572022 5 附录A （资料性）镰孢菌分离方法 A.1 常规组织分离法 切取小块病健交界处组织，经表面消毒和灭菌水清洗过后，在适宜的培养基和生长条件下培育纯菌丝的一种简易方法。A.2 单孢分离法 用灭菌水将 SN 培养基培养的镰孢菌分生孢子悬浮液稀释为 1 103 个/mL 的溶液，然后吸取 200 L 溶液均匀涂布于 PDA 培养基上，25 黑暗培养 24 h 后，挑取萌发的单个分生孢子于新的 PDA 培养基中，25 暗培养。DB22/T 33572022 6 附录B （资料性）玉米
9、镰孢根腐病病原菌 B.1 学名和形态描述 B.1.1 禾谷镰孢（无性态）/玉蜀黍赤霉菌（有性态）无性态学名：Fusarium graminearum Schwabe 有性态学名：Gibberella zeae（Schwein.）Petch 无性态特征：大型分生孢子呈镰刀状，有隔膜 3 个7 个，顶端钝圆或略微收缩，基部有明显的足细胞，具有 3 个4 个分隔的分生孢子大小为（25 m40 m）（2.5 m4 m），具有 5 个7 个 分隔的分生孢子大小为（48 m50 m）（3 m3.5 m）（图 B.1）；小型分生孢子极少或无，无厚垣孢子。有性态特征：子囊壳卵圆状，直径约 140 m250 m
10、；子囊长棒状，（60 m85 m）（8 m11 m），内含 8 个子囊孢子，（19 m24 m）（3 m4 m）。图B.1 禾谷镰孢的菌落形态和分生孢子形态 B.1.2 拟轮枝镰孢（无性态）/藤仓赤霉（有性态）无性态学名：Fusarium verticillioides（Sacc.）Nirenberg 有性态学名：Gibberella fujikuroi（Sawada）Wollew.无性态特征：小型分生孢子念珠状串生，无色，单胞，（5 m12 m）（2 m3 m）（图B.1）；大型分生孢子较少，无色，镰刀状，略弯，两端尖，3 个5 个分隔，（15 m60 m）（2 m5 m）。有性态特征：较少
11、形成，子囊壳球状，直径 220 m300 m；子囊长棒状，内含 8 个子囊孢子；子囊孢子大小（14 m18 m）（4.5 m6 m）。DB22/T 33572022 7 图B.2 拟轮枝镰孢的菌落形态和分生孢子形态 B.2 镰孢菌的分子鉴定 特异性检测：针对镰孢菌脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic,DNA）中属和种的特异性序列，用特异性引物进行扩增。特异性引物、扩增产物大小及扩增所需要的退火温度见表 B.1。表B.1 禾谷镰孢、拟轮枝镰孢和镰孢属的特异性引物 检测真菌 引物 引物序列（53）扩增片段（bp）退火温度（）F.graminearum FG1 TTGGTCTACAAATT
12、TCCAATGTGCTG 557 55 FG2 TTGGTCTAAGCGTCTGATAGCCATGT F.verticillioides VER1 CTTCCTGCGATGTTTCTCC 578 56 VER2 AATTGGCCATTGGTATTATATATCTA Fusarium spp.ItsF AACTCCCAAACCCCTGTGAACATA 431 58 ItsR TTTAACGGCGTGGCCGC DB22/T 33572022 8 附录C （资料性）镰孢菌培养基配方 C.1 PDA 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextrose agar medium，PDA）：马
13、铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 18 g20 g，蒸馏水 1000 mL。C.2 SN 培养基 合成低营养培养基（Spezieller N hrstoffarmer，SN）：磷酸二氢钾 1 g，硝酸钾 1 g，七水硫酸镁 0.5 g，氯化钾 0.5 g，葡萄糖 0.2 g，蔗糖 0.2 g，蒸馏水 1000 mL。C.3 高粱粒培养基 高粱粒浸泡 12 h，然后煮 30 min 40 min，装入三角瓶中于 121 下灭菌 1 h，后放入室温冷却，备用。DB22/T 33572022 9 附录D （资料性）田间小区排列图 田间小区排列见图D.1。保护行 4 垄6 垄 或 10 m 最少 10 m 保护行 4 垄6 垄或 10 m 试验小区 最少 10 m 图D.1 田间小区排列图