1、ICS 01.120 A 00 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 34882019 猪链球菌的分子分型 MLST 方法 Multilocus sequence typing detection method for Streptococcus suis 文稿版次选择 2019-12-25 发布 2020-01-25 实施安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 34882019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽浩翔农牧有限公司提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽浩翔农牧有限公司、安徽冠华农牧有限公司、安徽杜
2、洛克种猪育种有限责任公司、安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、阜阳市动物卫生监督所、怀宁县动物疫病预防与控制中心，巢湖市畜牧兽医局、六安市动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：高亚飞、占松鹤、何长生、谢玉洁、程竹兵、李春芬、程圣芳、段倩倩、李郁、孙裴、袁献宇、刘雪兰、徐小伟、高亚成。DB34/T 34882019 1 猪链球菌的分子分型 MLST 方法 1 范围 本标准规定了猪链球菌的分子分型 MLST 的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、生物安全和防污染措施。本标准适用于猪链球菌的分子分型检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用
3、文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 DB34/T 2996 猪链球菌检验操作规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 MLST multilocus sequence typing 一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，通过 PCR 扩增多个管家基因内部片段，测定其序列，分析菌株的变异，从而进行分型。3.2 管家基因 house-keeping genes 所有细胞中均
4、要表达的一类基因，其产物是维持细胞生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。4 试剂和材料 4.1 实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。4.2 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，应用无 DNA 酶污染的容器分装。4.3 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。4.4 普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒。4.5 Taq DNA 酶。DB34/T 34882019 2 4.6 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。4.7 引物：猪链球菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列见表 1。表1 猪链球菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列 名称 序列（53）
5、aroA（Forward）TTCCATGTGCTTGAGTCGCTA aroA（Reverse）ACGTGACCTACCTCCGTTGAC cpn60（Forward）TTGAAAAACGTRACKGCAGGTGC cpn60（Reverse）ACGTTGAAIGTACCACGAATC dpr（Forward）CGTCTTTCAGCCCGCGTCCA dpr（Reverse）GACCAAGTTCTGCCTGCAGC gki（Forward）GGAGCCTATAACCTCAACTGG gki（Reverse）AAGAACGATGTAGGCAGGATT mutS（Forward）ACTGGGGCA
6、TAAGGTCG mutS（Reverse）TGGCTGTCTTAGTTTCGTC recA（Forward）TATGATGAGTCAGGCCATG recA（Reverse）CGCTTAGCATTTTCAGAACC thrA（Forward）GATTCAGAACGTCGCTTTGT thrA（Reverse）AAGTTTTCATAGAGGTCAGC 4.8 10PCR 缓冲液：见附录 A.1。4.9 1琼脂糖凝胶。4.10 Gelred 核酸染色剂。4.11 6 溴酚蓝上样缓冲液。4.12 分子量标记：1000 bp DNA marker。4.13 5TBE 电泳缓冲液：见附录 A.2。使用
7、时稀释为 0.5 TBE 电泳缓冲液。4.14 质控菌株：猪链球菌。5 仪器和设备 5.1 离心机：转速 500015000 r/min。5.2 电子天平：感量 0.1 g。5.3 pH 计。5.4 涡旋振荡器。5.5 PCR 仪。5.6 电泳仪。5.7 凝胶成像仪。5.8 基因测序仪。5.9 超净工作台 5.10 移液器：0.1 L2.5L、2 L20 L、20 L200 L、100 L1 000L。6 操作步骤 DB34/T 34882019 3 6.1 细菌基因组 DNA 提取 使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒，提取经过 DB34/T 2996 的方法鉴定为猪链球菌的 DNA。6.2
8、MLST 基因选择 按表2 选择猪链球菌的 7 个管家基因进行 MLST 分析。表2 猪链球菌的管家基因 基因名称 片段大小 bp 管家基因名称 aroA 565 5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因（5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase）cpn60 507 60 KDa伴侣蛋白基因（60 KDa chaperonin）dpr 466 过氧化物抗性基因（peroxide resistance）gki 550 葡萄糖激酶基因（glucose kinase）mutS 618 DNA 错配修复蛋白基因（DNA mismatch repair pr
9、otein）recA 427 同源重组因子基因（homologous recombination factor）thrA 580 天冬氨酸激酶基因（aspartokinase）6.3 PCR 扩增引物和测序引物合成 按表1 合成猪链球菌 7 个管家基因对应的 7 对 PCR 扩增引物和测序引物。引物使用前稀释到 10 mol/L。6.4 管家基因片段的 PCR 扩增 反应体系体积为 50 L：10PCR 缓冲液 5 L、dNTP(2.5 mmol/L)4 L、上下游引物各(10 mol/L)1 L、Taq DNA 聚合酶(5 U/L)0.5 L、模板 DNA 5 L、双重蒸馏水补齐至 50 L
10、。反应条件为：预变性 95 5 min；变性 95 60 s，退火 45 30 s，延伸 72 30 s，进行 35个循环；72再延伸 10 min。将 PCR 产物进行 1琼脂糖凝胶电泳，在波长为 256 nm 的紫外光下成像观察，出现标准 Marker条带和依次单一明亮的条带时（参见附录B 图B.1），对相应样品进行 PCR 产物纯化。6.5 PCR 产物纯化 利用普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒纯化回收 PCR 产物。6.6 DNA 序列测定 按照表1 的测序引物，运用 Sanger 测序法对纯化的 PCR 产物进行 DNA 序列双向测序。6.7 结果报告 将所得到的猪链球菌 7 个管
11、家基因测序结果上传至 MLST 网站(https:/pubmlst.org)进行在线数据分析，得到的结果与 MLST 数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定猪链球菌分离株的序列型（Sequence Type，ST），并与 PubMLST 数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定 STs 的基础上应用 eBURST 程序将菌株分为各个谱系组/克隆复合物（clonal complex），构建系统遗传进化树作聚类分析（参见附录B 图B.2)。DB34/T 34882019 4 7 生物安全及防污染措施 7.1 生物安全措施 按照 GB 19489 中的有关规定执行。7.2 防污染措施 防污
12、染措施应符合 GB/T 27401 的规定。DB34/T 34882019 5 A A 附 录 A（规范性附录）缓冲液的配制 A.1 10PCR 缓冲液 A.1.1 成分 1mol/L Tris-HCl（pH 8.3）1.00 mL 1mol/L氯化钾 5.00 mL 1mol/L氯化镁 0.15 mL 双重蒸馏水 3.85 mL A.1.2 制法 将A.1.1 中各成分溶解于双重蒸馏水中，混匀，储存于-20备用。A.2 5TBE 电泳缓冲液 A.2.1 成分 Tris 54.0 g 硼酸 27.5 g 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0）20.0 mL 蒸馏水 补齐至 1000 mL
13、 A.2.2 制法 将A.2.1 中各成分溶解于蒸馏水中，定容至 1000 mL，混匀，储存于 2225备用。DB34/T 34882019 6 B B 附 录 B（资料性附录）猪链球菌管家基因 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测 按照猪链球菌 7 个管家基因的扩增引物序列进行 PCR 扩增，PCR 产物经 1琼脂糖凝胶电泳，在波长为 256 nm 的紫外光下成像观察，出现标准 Marker 条带和依次单一明亮的条带，见图B.1。图B.1 猪链球菌管家基因 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图 系统遗传进化树的构建 将所得到的猪链球菌 7 个管家基因扩增片段进行 MLST 分析，获得菌株所对应
14、的等位基因图谱，确定猪链球菌分离株的序列型（Sequence Type，ST），并与 PubMLST 数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定 STs 的基础上应用 eBURST 程序将菌株分为各个谱系组（clonal complex），构建系统遗传进化树。图B.1 为猪链球菌进行 MLST 分析后绘制的系统遗传进化树图。数据库中存在的 ST 型均用一个圆点（黄色）表示，绿色为复合物主要创建者，蓝色表明相应复合物名称，红色表示本试验包含的ST 型。图B.2 猪链球菌的系统遗传进化树图 _ Marker dpr thrA aro-A cpn60 gki recA mutS 500 1000 750 2000 250 100