1、ICS 65.020.20 B 44 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 22462020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量 RTPCR 检测方法 Real-time PCR detection technique for Japanese encephalitis virus 2020-03-03 发布 2020-04-03 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 22462020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009的规定编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：
2、谢荣辉、张传亮、吴赟竑、徐辉、刘霞、周蕾、柴娟、虞一聪、王雅婷、周彩琴、赵灵燕、刘爱军、吴雪军。DB33/T 22462020 1 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量 RTPCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）荧光定量RTPCR检测的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 猪流行性乙型脑炎 由猪流行性乙型脑炎病毒引起的一种急性传染病。猪的主要临床症状表现为高热、流产、死胎和公猪睾丸炎。3 实验条件 3.1 仪器 3.1.1
3、 高速冷冻离心机。3.1.2 荧光定量 PCR 仪。3.1.3 生物安全柜。3.1.4 组织研磨仪。3.1.5 微量移液器。3.1.6 冰箱。3.1.7 涡旋混匀器。3.1.8 高压灭菌器。3.2 试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器分装。3.2.1 Trizol：核糖核酸（Ribonucleic acid,RNA）提取试剂。3.2.2 氯仿：4 预冷。3.2.3 异丙醇：4 预冷。3.2.4 焦炭酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate,DEPC）水：取 DEPC 100 L，加超纯水至 100 mL，室温过夜，121 高压灭菌 15 mi
4、n，分装，冻存备用。3.2.5 75%乙醇：用 75 mL 无水乙醇，加 DEPC 水至 100 mL，混匀，20 预冷。DB33/T 22462020 2 3.2.6 商品化的一步法实时荧光 RT-PCR 反应试剂：One Step Prime Script RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA)，含有 2 One Step RT-PCR Buffer、Ex Taq HS（5 U/L）、PrimeScript RT Enzyme Mix 和无 RNA 酶的水。3.2.7 0.01mol/L PH7.4 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered sa
5、line,PBS）：取 Na2HPO4.12H2O 2.9g,KCl 0.2g,KH2PO4 0.2g,NaCl 8g,溶于 800 mL 去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH 调节至7.4，然后加去离子水定容至 1 L，高温灭菌 30 min，室温保存。3.2.8 引物和探针，其序列如下：上游引物：5GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT-3，下游引物：5TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3，探针：5FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-3。3.2.9 阳性对照：猪乙型脑炎活疫苗（SA14-14-2 株）。4 操作步骤 4.1 样品采集
6、 4.1.1 脑组织：选择代表性病症的病死猪，应无菌采集脑组织，将采集到的脑组织装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检或-20 以下保存备用。4.1.2 全血：用无菌注射器耳静脉采集猪血，将采集到的猪血装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检。若不能及时送检的全血，应分离血清置于-20 以下保存备用。4.2 样品处理 4.2.1 取待检脑组织适量装入到无菌离心管中，按 1：10 体积加入 PBS，置于组织研磨仪中充分研磨。将研磨后的样品，反复冻融 3 次，10000 r/min 离心 5 min，取上清液至无菌离心管中，编号待检。4.2.2 取全血 3500 r/min 离心 5 min，取血清至无菌离
7、心管中，编号待检。4.3 RNA 提取 4.3.1 按下列步骤完成 RNA 提取，也可采用商品化的病毒 RNA 提取试剂盒。4.3.2 取 n 个灭菌的 1.5mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，对每个离心管进行编号。4.3.3 每管加入 750 L Trizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各 250ul,震荡数次，静置5 min。再加入 200 L 预冷的氯仿，震荡混匀，静置 5 min，于 4 C 12 000 r/min 离心 15 min。4.3.4 取与本标准 5.3.2 中相同数量的灭菌 1.5ml 离心管，并对每个离心管进行编号。取本标准 5.3
8、.3中离心后的上清液（注意不吸出中间层）转移至相应的管中，加入等体积异丙醇，混匀，20 C 静置30 min。4.3.5 于 4 C 12 000 r/min 离心 15 min，弃上清，缓缓加入 1 mL 75%乙醇，颠倒洗涤沉淀及管壁。于 4 C 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清，室温条件下干燥后，加入 30 L DEPC 处理水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，以 4 000 r/min 离心 10 s,冰上保存备用。提取的 RNA 应在 2 h 内进行荧光 RT-PCR扩增，若需长期保存，需置于-70 C 冰箱保存。4.4 荧光定量 RTPCR 反应 4.4.1 反
9、应体系组成 设立阳性对照、阴性对照，反应体系（20L）由表1中物质组成。DB33/T 22462020 3 表1 反应体系配制表 试剂 用量L 2One Step RT-PCR Buffer 10 Ex Taq HS（5 U/L）0.4 PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4 上游引物（10 mol/L）0.4 下游引物（10 mol/L）0.4 探 针(10 mol/L)0.4 样品RNA 4 RNase Free dH2O 4 总 量 20 4.4.2 反应条件 反转录：42 15 min；预变性：94 2 min；扩增：94 10 s，60 40 s，45个循环，60
10、 时设置采集荧光。4.4.3 荧光素的设定 Report Dye 设定为FAM，Quencher Dye设定为none。5 结果判定 5.1 结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。5.2 质控标准 阳性对照的Ct值应30并出现典型的扩增曲线，阴性对照无Ct值且无典型扩增曲线，二者同时成立可判定试验成立，否则试验无效。5.3 结果描述及判定 5.3.1 阴性判定 无Ct值，且无典型扩增曲线，判为阴性。5.3.2 阳性判定 Ct值35，且出现典型扩增曲线，判为阳性。5.3.3 可疑判定 Ct值35，且出现典型扩增曲线的样品，需重复检测；重复检测结果Ct值38且出现典型扩增曲线的判为样品阳性，否则判为阴性。