1、ICS 65.020.20 B 22 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 14342011 抗虫和耐除草剂玉米 Bt176 及其衍生品种实时荧光 PCR 检测方法 Real-time PCR method for insect-resistant and herbicide-tolerant maize Bt176 and its derivates 2011-05-11 发布 2011-06-11 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 14342011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省技术监督局提出。本标准由安徽省质量技术监督
2、局归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研究所和安徽省标准化研究院。本标准主要起草人：汪秀峰、杨剑波、李莉、陆徐忠、马卉、张士胜、倪大虎、宋丰顺、陈萍、倪金龙、杨亚春、张毅。DB34/T 14342011 1 抗虫和耐除草剂玉米 Bt176 及其衍生品种实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了转基因抗虫和耐除草剂玉米 Bt176 的实时荧光PCR转化体特异性检测方法。本标准适用于转基因抗虫和耐除草剂玉米 Bt176 及其衍生品种，以及相关制品中 Bt176 成分的实时荧光 PCR 定性检测方法。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注
3、日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求和定义 NY/T 673 转基因植物及其产品检测 抽样 NY/T 674 转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化 农业部 869 号公告-8-2007 抗虫和耐除草剂玉米 BT176 及其衍生品种定性 PCR 方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 基因 zSSIIb zSSIIb gene 玉米醇溶蛋白基因。3.2 Bt176 转化体特异性序列 event-specific sequ
4、ence of Bt176 外源插入载体 3 端与玉米基因组的连接区序列，包括 bar 基因部分序列和玉米基因组部分序列。3.3 实时荧光 PCR Real-time PCR 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量的分析。3.4 阈值 threshold DB34/T 14342011 2 实时荧光 PCR 中以 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是 315 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。3.5 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。4 原理 实时
5、荧光 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个 PCR过程。TaqMan 荧光 PCR 技术是以 TaqMan 荧光探针为基础，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5-3 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。根据玉米内标准基因 zSS
6、IIb 和 Bt176 转化体特异性序列，分别设计引物和探针进行 PCR 扩增，建立玉米内标准基因 zSSIIb 和 Bt176 转化体实时荧光 PCR 检测方法，根据检测结果判断试样中是否含有转基因成分 Bt176。5 试剂与材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。5.1 琼脂糖。5.2 70乙醇（V/V）。5.3 10 mg/mL RNase A：将胰 RNA 酶（RNase A）溶于 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成 10 mg/mL 的浓度，于 100 加热 15 min，缓慢冷却
7、至室温，分装成小份保存于-20。5.4 10 mol/L NaOH 溶液:在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容到 200 mL。5.5 500mmol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8.0):称取乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2)18.6 g，加入 70 mL 水中，再加入 10 mol/L NaOH 溶液，加热溶解后，冷却至室温，再用 10 mol/L NaOH 溶液调 pH 至8.0，加水定容到 100 mL，在 103.4 kPa(121)灭菌 20 min。5.6 TE 缓冲液（pH 8.0):1 mol/L Tris-HCl（pH 8.
8、0）10 mL 和 500 mmol/L EDTA（pH 8.0）溶液 2 mL，用水定容至 1000 mL。5.7 dNTPs 混合溶液:将浓度为 10 mmol/L 的 dATP，dCTP，dGTP，dTTP 四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。5.8 适用于 PCR 反应的 Taq DNA 聚合酶（5 U/L）及其反应缓冲液。5.9 引物和探针:序列信息应按附录 A 执行。用 TE 缓冲液（5.6）或重蒸馏水将上述引物和探针稀释到 10 mol/L 储存备用。注：探针应避光保存。5.10 植物 DNA 提取试剂盒。5.11 定量 PCR 反应试剂盒。DB34/T 14342011 3 6 仪器
9、 6.1 分析天平：感量 0.1 g 和 0.1 mg。6.2 普通 PCR 仪和 Real-time PCR 仪。6.3 重蒸水发生器或超纯水仪。6.4 核酸定量仪。6.5 其他相关仪器设备。7 操作步骤 7.1 抽样和制样 按 NY/T 672 和 NY/T 673 规定的执行。7.2 试样预处理 按 NY/T 674 规定的执行。7.3 DNA 模板制备 按 NY/T 674 规定的执行，或使用经验证适用于玉米 DNA 提取和纯化的植物 DNA 试剂盒。7.4 DNA 提取质量测定 紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是 2 g/mL50 g/mL。当提取的 DNA 溶液OD260nm/
10、OD280nm 的比值在 1.72.0 时，满足 PCR 检测要求。7.5 对照设置 在 PCR 反应的同时，应设置阴性对照和空白对照。以非转基因玉米 DNA 作为阴性对照 PCR 反应体系的模板；以转基因玉米 Bt176 DNA 作为阳性对照的模板；以重蒸水作为空白对照 PCR 反应体系的模板。7.6 PCR 定性检测 按农业部 869 号公告-8-2007 规定的执行。当 PCR 反应体系正常工作时，试样中扩增出内标准基因 zSSIIb，说明试样提取的 DNA 满足 PCR检测要求。同时，对试样进行转化体 Bt176 的检测，若出现扩增条带，且扩增大小与预期片段大小一致，则初步判断样品中含
11、有转化体 Bt176，应通过实时荧光PCR进一步确认；若无扩增条带，则判定试样中不含有转化体 Bt176。7.7 实时荧光 PCR 检测 7.7.1 实时荧光 PCR 体系及反应条件。实时荧光 PCR 体系反应体系和反应条件参照附录 B 和附录 C 执行。反应体系和反应条件应根据试剂要求进行适当调整。每个反应体系设置 3 个平行。7.7.2 质控标准 DB34/T 14342011 4 在扩增内标准基因 zSSIIb 时，空白对照荧光曲线平直，阴性对照和阳性对照出现典型的扩增曲线，或空白对照荧光值低于阴性对照和阳性对照荧光值的 15，表明反应体系正常工作；在扩增检测转化体Bt176 时，空白对
12、照和阴性对照的荧光曲线平直，阳性对照出现典型的扩增曲线，且检测 Ct 值36 或空白对照和阴性对照的荧光值低于阳性对照荧光值的 15，表明反应体系正常工作。否则，表明 PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。8 结果分析与表述 a)试样中内标准基因检测 Ct 值36，转化体 Bt176 检测 Ct 值40，则表明该试样中不含转基因成分 Bt176。表述为“样品中未检测出抗虫和耐除草剂玉米 Bt176，检测结果为阴性”。b)试样中内标准基因检测 Ct 值36，转化体 Bt176 检测 Ct 值36，则表明该试样中含有转基因成分 Bt176。表述为“样品中检测出抗虫和耐除草剂玉米 Bt176，
13、检测结果为阳性”。c)试样中转化体 Bt176 检测 Ct 值在 3640，则需调整模板浓度，重新检测。经重复检测后，当检测体系正常时，转化体 Bt176 检测 Ct 值40，则表明该试样中含有转基因成分 Bt176，表述为“样品中检测出抗虫和耐除草剂玉米 Bt176，检测结果为阳性”；否则，表明该试样中不含转基因成分 Bt176，表述为“样品中未检测出抗虫和耐除草剂玉米 Bt176，检测结果为阴性”。9 防污染措施 转基因抗虫和耐除草剂玉米 Bt176 的实时荧光 PCR 检测过程的防污染措施应符合 NY/T 672 的规定。DB34/T 14342011 5 A A 附 录 A（规范性附录
14、）实时荧光 PCR 检测引物和探针序列信息 表A.1 被检测基因 引物或探针序列 扩增长度/bp zSSIIb-F:5-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3 zSSIIb-R:5-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3 zSSIIb zSSIIb-P:5-FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA-3 88bp Bt176-F:5-GTGCATCAATGGAGGAGAGAAC-3 Bt176-R:5-GACTTCAGCCTGCCGGTACT-3 Bt176 Bt176-P:5-FAM-TCTCGGTGACGGGCAGGACC-TAMRA-3 7
15、7bp DB34/T 14342011 6 B B 附 录 B（规范性附录）实时荧光 PCR 检测反应体系 表B.1 试 剂 终浓度 体 积 水 8 L 2TaqMan Mix 1 12.5 L 10 mol/L 上游引物 0.4 mol/L 1 L 10 mol/L 下游引物 0.4 mol/L 1 L 10 mol/L 探针 0.2 mol/L 0.5 L 25 mg/L DNA 模板 2 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 注1：如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积无菌水。注2：玉米内标准基因 PCR 检测反应体系中，上下游引物和探针分别为 zSSIIbF/R 和 zSSIIbP；转基因玉米Bt176 转化体 PCR 检测反应体系中，上下游引物和探针分别为 Bt176F/R 和 Bt176-P。DB34/T 14342011 7 C C 附 录 C（规范性附录）实时荧光 PCR 检测反应条件 表C.1 被检测基因 预变性 扩增 循环数 zSSIIb Bt176 95,10 min 95,15 s；60,1 min 读板 40 _