1、ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 36602020 鸭肝炎病毒 1 型和 3 型双重 RT-PCR 检测方法 Duplex RT-PCR assay for detection of duck hepatitis virus type 1 and type 3 文稿版次选择 2020-08-03 发布 2020-09-03 实施安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 36602020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：
2、安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、安徽省动物疫病预防与控制中心、太湖县小池镇农业农村综合服务中心、合肥野生动物园、铜陵市动物疫病预防与控制中心、铜陵市义安区畜牧兽医局。本标准主要起草人：潘孝成、占松鹤、沈学怀、何学丰、郭长进、范萍萍、尹磊、赵瑞宏、戴银、何为俊、吴娟、胡晓苗、侯宏艳、周学利、张丹俊、周迎春、王军。DB34/T 36602020 1 鸭肝炎病毒 1 型和 3 型双重 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了鸭肝炎病毒1型（DHV-1）和鸭肝炎病毒3型（DHV-3）双重RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于鸭病变肝组织、接种疑似病料的鸭胚尿囊液或细胞培养物中DHV-1型和
3、DHV-3型核酸的检测。2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。DHV：鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction）RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphospha
4、te）M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus）PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（tris acetate-EDTA buffer）EB：溴化乙锭（ethidium bromide）3 主要仪器 3.1 PCR 扩增仪。3.2 台式低温高速离心机（最大离心力 12000 g 以上）。3.3 电泳仪。3.4 凝胶成像系统。3.5 冰箱（-20；-80）。3.6 微波炉。3.7 分析天平（感量 0.01 g）。3.8 水浴锅。3.9 微量移液器（2.5 L；10 L；200
5、L；1000 L）。4 试剂 4.1 RNA 抽提试剂：Trizol 或其他商品化 RNA 提取试剂。4.2 氯仿、异丙醇、无水乙醇，均为分析纯。DB34/T 36602020 2 4.3 M-MLV 反转录酶。4.4 RNA 酶抑制剂。4.5 DEPC 处理的灭菌水。4.6 Taq DNA 聚合酶。4.7 dNTP。4.8 DNA 分子标准（DNA Marker）。4.9 RT-PCR 反应试剂。4.10 EB（10 g/L）或核酸染料。4.11 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2），见附录 A 中的 A.1。4.12 50TAE 电泳缓冲液，见附录 A 中的 A.2。
6、4.13 1琼脂糖凝胶，见附录 A 中的 A.3。4.14 引物：DHV-1 扩增上游引物，5-GGTGATTCTAACCAGTTGGGG-3，下游引物，5-TTCAATTTCCAGATTGAGTTCAAA-3；DHV-3 扩增上游引物，5-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3，下游引物，5-ACGAACCAGCCATTGACG-3，引物浓度均为 10 pmol/L。4.15 阳性对照样品：DHV-1 和 DHV-3 鸭胚接种尿囊液毒；阴性对照样品：正常鸭胚尿囊液。5 样品的采集及处理 5.1 采样工具 15 mL 离心管、1.5 mL 离心管、剪刀、镊子和研钵，经 121（2
7、），15 min 高压灭菌并烘干。5.2 采样与处理 5.2.1 鸭病变肝组织 采取病死或剖杀鸭的肝组织 1 g 左右，按 1:5 倍体积加入 0.01 mol/L pH 7.2 PBS，研磨冻融 3次，装入 15 mL 灭菌离心管中，8000 g 离心 10 min，取上清液转入 1.5 mL 离心管中，-80保存备用。5.2.2 鸭胚尿囊液和细胞培养物 鸭胚尿囊液、细胞培养物冻融 3 次，转入 1.5 mL 离心管中，-80保存备用。6 RT-PCR 检测 6.1 RNA 提取 6.1.1 用 Trizol 或其他商品化 RNA 提取试剂提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的 RNA。6.
8、1.2 200 L 的样品和 800 L Trizol 置于一个 1.5 mL 离心管，反复颠倒混匀，室温静置 5 min。6.1.3 12000 g 4离心 5 min，吸取上清液移入新的离心管中，加入 200 L 氯仿，剧烈振荡 15 s，室温静置 5 min。6.1.4 12000 g 4离心 15 min，吸取上清液移入新的离心管中（注意不要吸出中间层），加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置 10 min。6.1.5 12000 g 4离心 10 min，小心弃去上清液，加入 75乙醇 1 mL（DEPC 水配制）。6.1.6 12000 g 4离心 5 min，弃去乙醇，室温干燥
9、 25 min，加入适量 DEPC 水，-80保存备用。DB34/T 36602020 3 6.2 反转录（cDNA 合成）6.2.1 在 PCR 反应管中依次加入：Oligo dT Primer or Random Primers 1 L，dNTPs(10 mmol/L)1 L，检测样品 RNA 3 L，DEPC 水 6 L。6.2.2 水浴锅或 PCR 仪中，65 作用 5 min，冰上急冷 2 min。6.2.3 在上述反应管中再依次加入：5RT Buffer 4 L，RNase Inhibitor（40 U/L）0.5 L，M-MLV 反转录酶（200 U/L）1 L，DEPC 水 3
10、.5 L。6.2.4 PCR 仪中，42 作用 60 min，再 70 作用 15 min，-20保存备用。6.3 PCR 反应 6.3.1 PCR 反应体系 10PCR Buffer 2.5 L，DHV-1 和 DHV-3 上游引物各 1 L，DHV-1 和 DHV-3 下游引物各 1 L，dNTPs(2.5 mmol/L)2 L，Taq DNA 聚合酶 0.25 L，反转录产物 5 L，灭菌去离子水 11.25 L，总反应体系 25 L。6.3.2 PCR 反应条件 94 5 min；94 1 min，52 50 s，72 1 min，35 个循环；72 10 min。6.4 电泳检测 将
11、 PCR 扩增产物 5 L 与 2 L 上样缓冲液混合，点样于 1琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入 DNA Marker III，缓冲液为 1TAE，以 5 V/cm 电压电泳 30 min 左右。电泳后，置于凝胶成像系统下观察，根据 DNA 分子质量大小（DNA marker）判断 RT-PCR 扩展产物大小。7 结果判定 7.1 当阳性对照在预期大小的位置 720 bp 和 642 bp 出现特异性条带，阴性对照均未出现预期大小目的条带时，实验结果成立。7.2 被检样品在 720 bp 位置出现特异性条带为 DHV-1 核酸阳性，被检样品在 642 bp 位置出现特异性条带
12、为 DHV-3 核酸阳性。如图 1 所示。DB34/T 36602020 4 图中：M DL2000 Marker；1 阳性对照样品；2 DHV-1 阳性样品；3 DHV-3 阳性样品；4 阴性对照样品。图1 PCR 扩增电泳图 DB34/T 36602020 5 A A 附 录 A（规范性附录）试剂配制 A.1 0.01 mol/L pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 A.1.1 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）71.6 g，先加适量灭菌去离子水溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。A.1.2 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取磷
13、酸二氢钠（NaH2PO4H2O）27.6 g，先加适量灭菌去离子水溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。A.1.3 量取 0.2 moL/L 磷酸氢二钠溶液 36 mL，0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液 14 mL，称取氯化钠 8.5 g，加灭菌去离子水 800 mL，调 pH 值至 7.2，最后定容至 1000 mL，4保存。A.2 电泳缓冲液（50 倍）A.2.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0）二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯）18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠（分析纯）调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.2.2 TAE 电泳缓冲液（50）羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）242 g 冰乙酸（分析纯）57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8.0)100 mL 灭菌双蒸水 加至 1000 mL A.3 1琼脂糖凝胶 琼脂糖（电泳级）1 g 1TAE 电泳缓冲液 100 mL 微波炉中完全融化，降温至 60左右，加 EB 或核酸染料 5 L，均匀铺板。_