1、 ICS 65.020.01 B 01 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 23122013 转 hLTF 基因奶牛的 PCR 鉴定技术规程 Procedures for PCR Identification of Human Lactotransferrin Gene in Transgenetic Dairy Cattle 2013-04-01 发布 2013-05-01 实施山东省质量技术监督局 发 布 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 23122013 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧
2、业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业大学、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司。本标准主要起草人：黄金明、侯明海、鞠志花、张思聪、冯敏燕、李秋玲、王长法、齐超、张燕、李建斌、何洪彬、戴蕴平、仲跻峰。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 23122013 1 转 hLTF 基因奶牛的 PCR 鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了转hLTF基因奶牛的分子鉴定技术方法。本标准适用于转hLTF基因奶牛中转基因成分的分子检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日
3、期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 NY/T 1672 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程 SN/T 1917 牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程 NYB 953-5 转基因动物及其产品成分检测 促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法 DB37/T 2037 牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 hLTF 基因 人乳铁蛋白基因。3.2 转 hLTF 基因奶牛 利用转基因技术将人乳铁蛋白基因导入奶牛
4、细胞或胚胎，通过克隆技术培育而成的奶牛。4 鉴定原理 针对转hLTF基因奶牛含有的hLTF基因，根据转入的外源的人LTF基因与内源的牛LTF基因的同源性，在编码区设计hLTF基因特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，用凝胶电泳检测产物，依据产物的有无来判定试样是否含有转hLTF基因成分，从而判定为转hLTF基因阳性或阴性奶牛。5 主要试剂配制 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 23122013 2 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T 6682的双蒸水；试剂配制应按照DB37/T 2037的规定执行。实验室应符合NY/T 672的规定。6 主要仪器设备 按照D
5、B37/T 2037中的规定执行。7 检测方法 7.1 样本采集 静脉采集血样3 mL5 mL，ACD抗凝，4 或-20 保存。亦可采集耳组织0.01 g0.05 g，液氮保存。7.2 试样 DNA 提取 7.2.1 血液 DNA 的提取 用酚-氯仿抽提法从抗凝血和血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的处理按照SN/T 1917的规定执行。DNA的提取按照 DB37/T 2037中的规定执行。也可用商业化DNA提取试剂盒提取DNA。7.2.2 组织 DNA 提取 组织样品DNA的提取方法，参照NYB 953-5执行，或者用商业化DNA提取试剂盒提取DNA。7.3 DNA 浓度和纯度检测 按
6、照NY/T 1672的规定执行。7.4 引物序列 用于扩增hLTF基因的特异引物序列。hLTF1：5-CTGGGACTAGAGGTGCTTGAC-3 hLTF2:5-GGCAGATGGTAGGAGGTAGGA-3 上述扩增片段的大小为921 bp。7.5 对照 DNA 样品的制备 7.5.1 阳性对照 DNA 样品 利用上述hLTF1和hLTF2引物对，以人的基因组DNA或者互补DNA为模版，采用常规PCR方法扩增hLTF基因片段，纯化后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌后，提取阳性克隆质粒，质粒（pMD18-hLTF）用测序验证。扩增的hLTF基因片段测序结果见附录A。7.5.2 阴性对
7、照 DNA 样品 从非转hLTF基因牛的血液或组织中提取DNA样品。7.6 PCR 扩增 7.6.1 PCR 扩增体系 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 23122013 3 产物扩增的PCR反应体系：模板DNA 50 ng、10Buffer 2.5 L、50 mmol/L MgCl2 1.2 L、10 mmol/L dNTP 0.6 L、Taq DNA聚合酶 2 U、10 mol/L的上游和下游引物各1.0 L、加双蒸水至反应总体积为25 L。7.6.2 PCR 扩增反应的设计 PCR扩增时包括以下反应管：若干待测样品（待测样品DNA为模板）管，空白对照（双蒸水作为模板）管，
8、阳性对照（质粒pMD18-hLTF为模板）和阴性对照（不含hLTF成分的牛基因组DNA为模板）管。7.6.3 PCR 扩增条件 94 预变性5 min；94 变性30 s，60 退火30 s，72 延伸30 s，35个循环；72 延伸5 min，4 保存。7.6.4 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 按照DB37/T 2037中的规定执行。8 结果判定 8.1 PCR 产物检测 PCR扩增产物的凝胶电泳检测结果如图1所示，第2、4、5、6、11和12泳道的PCR扩增产物大小为921 bp；第3、7、8、9和10泳道未出现条带。说明：1 DNA Marker；28 检测样品；9 阴性对照（不含hL
9、TF成分的牛DNA作为模板）；10 空白对照（双蒸水作为模板）；11和12阳性对照（质粒pMD18-hLTF）。图1 扩增的 PCR 产物 1%琼脂糖凝胶电泳检测结果 8.2 结果判定 8.2.1 对照样品结果分析 山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 23122013 4 阳性对照PCR反应中，扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照和空白对照中无扩增片段，表明PCR反应体系正常，否则重新检测。8.2.2 试样的检测结果分析与表述 如果试样的PCR产物经凝胶电泳后，可检测出预期大小的条带，表明试样中可检出hLTF基因。表述为“试样中检测出hLTF基因，结果为转hLTF基因阳性牛
10、”；如果试样扩增片段的大小与预期不一致，或者未扩增出条带，表明试样中未检出hLTF基因。表述为“试样中未检测出hLTF基因，结果为转hLTF基因阴性牛”。9 废弃物的处理 按照NY/T 1672的规定执行。山东省地方标准公开山东省地方标准公开DB37/T 23122013 5 AA 附 录 A（资料性附录）hLTF 基因片段的测序结果 1 TGGCAGATGG TAGGAGGTAG GACCAGAAGT GGTGCGAGGC CTGGATGCTG CCCAAGGCGG 61 GCCTGCCACC AGGAGTGTGG GGTGGGGGAC TCCACTAAGG AGGTGGAATG ACTCC
11、AGAAC 121 TCAGCTCCTT CTGCCCCATG GTTTTCTCAG GGCTGTTCTT GGGTGGAAGA AATACCCCTT 181 TGCCTCCTTT AACCCATAAA TTCCTCTTTT CCTTAGCTAC TCACTGTCTG CCCTTTTGTC 241 GCAGGCTAAA TTTGGGAGAA ATGGATCTGA CTGCCCGGAC AAGTTTTGCT TATTCCAGTC 301 TGAAACCAAA AACCTTCTGT TCAATGACAA CACTGAGTGT CTGGCCAGAC TCCATGGCAA 361 AACAACATAT
12、 GAAAAATATT TGGGACCACA GTATGTCGCA GGCATTACTA ATCTGAAAAA 421 GTGCTCAACC TCCCGTAAGT AGACCCTAGC TAGCATCCCC GAGAAACCAC CATGGGTGAA 481 GGTCAAGGTT TGAGGGCCAA ACAGCATTCT AGGAACGAAC ACAGGTGTAA AAATGTTAAG 541 GAAAGATAAT ATCTCTTTAC AGTTCAGGAA ATTATAATCT CATTGATAAA ATAATTAGAG 601 AATAAAATAG AGCAGTATGT AATAAATT
13、TT TATAAATTTT ATAGTACGGA TAGTGATGGC 661 ACTGTCATGA AATCTTTGGA AACTGATAAT CCATTTTATT CAGTAAAATG AAAGGTGCAT 721 ATATACATAT GCATTGAGAA ATGACAAAAC CAGCCACGTG TGATGGCTCA CACCTGTCAT 781 CCCACCACCT TGGGAAGCAG AGGTGGGAGG ATGGCTTGAG CCCGGGAGTT TGAGACCAAT 841 GTGGCCAACA CAGAGAGACC TTGTTCTACA AAAATAATTT TAAAAATTAG CCTGGTGTGG 901 TGTCAAGCAC CTCTAGTCCC A _ 山东省地方标准公开山东省地方标准公开