1、ICS 11.220 B 41 DB35 福建省地方标准 DB35/T 17602018 H7 亚型禽流感抗原胶体金免疫层析检测试纸条的制备和在活禽中快速检测技术规程 Preparation of Avian Influenza H7 antigen golden immuno-chromotography detection test strip and technical specification for rapid detection in live poultry 2018-04-03 发布 2018-07-03 实施福建省质量技术监督局 发 布 DB35/T 17602018 I
2、目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 疫病概述.1 4 原理.2 5 仪器设备和主要试剂.2 6 H7 亚型禽流感抗原胶体金免疫层析快检测试纸条的制备.3 7 活禽中 H7 亚型禽流感病毒快速检测.4 附录 A（规范性附录）溶液的配制.5 附录 B（资料性附录）胶体金免疫层析快速检测试纸条的装配示意图.7 DB35/T 17602018 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
3、、深圳市易瑞生物技术有限公司、厦门瑞德利校准检测技术有限公司、福州市疾病预防控制中心。本标准主要起草人：郑腾、张体银、唐寰宇、付辉、金虹、林杰、张险朋、李文最、杨年松、朱海、张永东、王武军、张志灯、白泉阳、李宋钰。DB35/T 17602018 1 H7 亚型禽流感抗原胶体金免疫层析检测试纸条的制备 和在活禽中快速检测技术规程 1 范围 本标准规定了H7亚型禽流感抗原胶体金免疫层析检测试纸条的制备要求和快速检测的原理及操作步骤。本标准适用于H7亚型禽流感抗原胶体金免疫层析快速检测纸条的制备，并适用于活禽中H7亚型禽流感病毒的快速诊断和初筛。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少
4、的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 疫病概述 3.1 H7 亚型禽流感病毒是 A 型流感病毒的一种亚型，属于正粘病毒科的 A 型流感病毒属。禽流感病毒颗粒外膜由两型表面糖蛋白组成，呈短杆状或球状，具有多形性，其中球形直径 80 nm120 nm，有囊膜，核衣壳为螺旋对称，基因组为分节段单股负链 RNA，大小约 14 000 个核苷酸，由 8 个片段组成，共编码 10 种蛋白，包括血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuram
5、inidase，NA）、基质蛋白（matrix protein，M1、M2）、依赖 RAN 的 RNA 聚合酶（PA、PBl、PB2）、核蛋白（nucleoprotein，NP）和非结构蛋白（nonstmctural protein，NSl、NS2）。依据其 HA 和 NA 蛋白抗原性不同，目前可分为 16 个 H 亚型（H1H16）和 9 个 N 亚型（N1N9）。理论上 HA 与 NA 的不同组合可形成多达 144 种不同的禽流感病毒，许多高致病性禽流感病毒常常为 H7 亚型，如可以引起人死亡的 H7N9 禽流感病毒就属于该亚型。3.2 高致病性禽流感在禽群之间的传播主要依靠水平传播（如空
6、气、粪便、饲料和饮水等），垂直传播则可以通过鸡蛋传播。病毒可以随病禽的呼吸道、眼鼻分泌物、粪便排出，禽类通过消化道和呼吸道途径感染发病。被病禽粪便、分泌物污染的任何物体，如饲料、禽舍、笼具、饲养管理用具、饮水、空气、运输车辆、人、昆虫等都可能传播病毒。许多家禽都可感染病毒发病：火鸡、鸡、鸽子、珍珠鸡、鹌鹑、鹦鹉等陆禽都可感染发病，但以火鸡和鸡最为易感，发病率和死亡率都很高；鸭和鹅等水禽也易感染，并可带毒或隐性感染，有时也会大量死亡。各种日龄的鸡和火鸡都可感染发病死亡，而水禽（如雏鸭、雏鹅）的死亡率较高。除野禽，如天鹅、燕鸥、野鸭、海岸鸟和海鸟等外，还从以下多种鸟中分离到流感病毒；燕八哥、石鸡、
7、麻雀、乌鸦、寒鸦、鸽、岩鹧鸪、燕子、苍鹭、加拿大鹅及番鸭等。据国外报道，已发现带禽流感病毒的鸟类达 88 种，而鼠类不能自然感染流感病毒。不同品种的家禽感染禽流感的几率不同，但目前尚未发现高致病性禽流感的发生与禽的性别有关。人类会通过与感染的物品、排泄物和感染禽类的分泌物接触发生感染。高致病性禽流感感染人后会使人产生严重的呼吸道症状，严重时可令人致死。DB35/T 17602018 2 4 原理 本标准是利用双抗体夹心法胶体金免疫层析技术检测样品中H7亚型禽流感病毒。如果样品中含有H7亚型禽流感病毒，在层析过程中样品中的H7亚型禽流感病毒HA蛋白会先与胶体金标记的特异性H7亚型禽流感抗原单克隆
8、抗体A结合形成抗原抗体复合物，并层析至硝酸纤维素膜上检测区时，该复合物被检测区固定的特异性H7亚型禽流感抗原单克隆抗体B捕获，并逐渐凝集成形成一条可见的检测线。而未被检测区捕获的复合物层析至质控区时，被质控区的二抗捕获，也逐渐凝集成形成一条可见的质控线。因此样品中含有H7亚型禽流感病毒时，检测线和质控线同时有可见条带；如果样品中不含有H7亚型禽流感病毒时，检测线则无可见条带，质控线有可见条带。如果质控线未出现条带，则表明试纸无效。5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 仪器设备主要包括以下几项：a)微量可调移液器（10 L、200 L、1 000 L）；b)恒温培养箱（25 5）；c)磁力搅
9、拌器；d)高速冷冻离心机（10 000 r/min12 000 r/min）；e)除湿机；f)切条机；g)划膜喷金机；h)冰箱（2 8）；i)计时器。5.2 主要试剂 主要试剂包括：a)氯金酸；b)叠氮钠（NaN3）；c)柠檬酸三钠；d)碳酸钾；e)H7 亚型禽流感抗原单克隆抗体 A；f)H7 亚型禽流感抗原单克隆抗体 B；g)甘氨酸；h)磷酸盐缓冲溶液（PBS）；i)牛血清白蛋白（BSA）；j)吐温 20（Tween-20）；k)蔗糖；l)聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；m)三羟甲基氨基甲烷（Tris）；n)抗鼠 IgG 多克隆抗体；o)硝酸纤维素膜；p)玻璃纤维结合垫；DB35/T 176020
10、18 3 q)聚氯乙烯底板（PVC 底板）；r)吸水滤纸；s)样品垫；t)H7 亚型禽流感抗原阳性对照和阴性对照，由指定单位提供。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682-2008中一级水的 要求。6 H7 亚型禽流感抗原胶体金免疫层析快检测试纸条的制备 6.1 胶体金颗粒的制备 6.1.1 取 1%的氯金酸(配制方法见附录 A 中的 A.1)1 mL，加入 99 mL 的水，制备稀释成 0.01%的氯金酸溶液。6.1.2 取 0.01%的氯金酸溶液 100 mL 置于干净的烧杯或锥形瓶中，在磁力搅拌器上加热并快速搅拌，待初沸，一次性快速加入 1%的柠檬酸三
11、钠溶液(配制方法见附录 A 中 A.2)1 mL，其后持续搅拌。应注意加液用的工具（如枪头或注射器等）和所有容器必须洁净，如果要重复使用必须经酸洗并用水冲净。6.1.3 虽然金的还原以及成核反应很迅速，但整个过程相对比较漫长，可以观察到明显的颜色变化。首先是氯金酸溶液的黄色，随后出现浑浊而呈现灰黑色，最后出现透亮的红色。此时可以停止加热，继续低速搅拌约 5 min 后，静置冷却至室温。6.1.4 待冷却后定容至 100 mL，避光待用。无需过滤，2 8 下冷藏存放，可保存半年，不可冷冻。6.1.5 胶体金应保存在洁净的玻璃器皿中，可以加入 0.02%的 NaN3作为防腐剂。保存不当时，会有细菌
12、生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。6.2 H7 亚型禽流感抗原单克隆抗体 A 的标记 6.2.1 取1 mL胶体金置于1.5 mL离心管内，加入0.2 mol/L碳酸钾(配制方法见附录A中A.3)10 L，并混匀。6.2.2 加入 4 g 的 H7 亚型禽流感抗原单克隆抗体 A 进行标记，混匀并静置 30 min。6.2.3 加入 0.2 mol/L 的甘氨酸(配制方法见附录 A 中 A.4)100 L 进行封闭，混匀并静置 30 min。6.2.4 在 4 下 10 000 r/min 冷冻离心 30 min，弃去上清液
13、。6.2.5 加入 100 L 重悬液（配制方法见附录 A 中的 A.5），搅匀后置于 2 8 下保存备用，保存时间不超过 15 d。6.3 样品垫的处理 将样品垫放入处理液（配制方法见附录A中的A.6）中完全浸湿，取出后在25 5 和相对湿度小于30%的条件下干燥样品垫，干燥时间必须超过24 h，密封保存备用。6.4 玻璃纤维结合垫的处理 6.4.1 取 6.2.5 中制备的胶体金重悬液 100 L，用划膜喷金仪按 6 L/cm 的速度直接喷涂。6.4.2 在 25 5 和相对湿度小于 30%的条件下干燥样品垫，干燥时间必须超过 24 h，密封保存备用。DB35/T 17602018 4 6
14、.5 反应膜的制备 6.5.1 检测线包被过程：用含有 0.1%BSA（w/v）的 0.01 mol/LPBS（pH7.6）（配制方法见附录 A 中的A.7）配制浓度为 2 mg/mL 的 H7 亚型禽流感抗原单克隆抗体 B。用划膜喷金机将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区，包被量为 1 L/cm。6.5.2 质控线包被过程：用含有 0.5%BSA（w/v）的 0.01 mol/LPBS（pH7.6）（配制方法见附录 A 中的A.7）配制浓度为 0.5 mg/mL 的抗鼠 IgG 多克隆抗体，用划膜喷金机将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区，包被量 1 L/cm。6.6 硝酸纤维素膜的干燥 在25 5
15、 和相对湿度小于30%的条件下，干燥硝酸纤维素膜至少24 h，密封保存备用。6.7 试纸条装配 在温度18 30 和相对湿度35%45%的条件下，将硝酸纤维素膜贴在PVC底板上。将吸水滤纸，齐纸板顶端贴在PVC底板上。将玻璃纤维素结合垫齐边贴在底板上，确保结合垫均有搭到硝酸纤维素膜。最后齐底板边缘贴好样品垫，确保样品垫均有搭到结合垫。检查贴好的大板，裁去任何有缺陷的部位。用切条机将贴好的大板裁切成所需4.0 mm的宽度。需要时可以将试纸条装入卡扣中。试纸条的装配示意图参见附录B。7 活禽中 H7 亚型禽流感病毒快速检测 7.1 样品的采集和制备 将棉拭子探入泄殖腔转几圈并沾取泄殖腔分泌物，放入
16、盛有500 L样品稀释液（配制方法见附录A中的A.8）的1.5 mL离心管中，混匀后静止5 min，待检。可以在2 8 下冷藏保存，但时间不宜超过24 h。7.2 H7 亚型禽流感病毒的检测 低温保存的样品或试纸条使用前应先平衡到室温（15 30）后方可使用，现场采集的样品可立即使用。用移液器或滴管吸取处理后的样品90 L加于加样孔中，同时取H7亚型禽流感抗原阳性对照和阴性对照各90 L加于加样孔中，水平放置，15 30 条件下反应5 min后，在5 min内观察结果。7.3 检测结果的判定 7.3.1 通过对比质控线和检测线的颜色深浅来进行结果判定。由于长时间放置会引起检测带颜色的变化，需在 10 min 内进行结果判定。7.3.2 阳性对照检测线出现红色条带，而阴性对照检测线没有条带，且两者的质控线均出现红色条带，说明该批试纸条有效；否则说明该批试纸条已失效。7.3.3 待检样品的质控线和检测线均出现红色条带，判为阳性；质控线出现红色条带，而检测线没有出现红色条带，判为阴性；若质控线没有出现红色条带，则结果无效，需要重新检测。7.3.4 对于检测结果判为阳性的样品，需要将该样品送到