1、 ICS 11.220 CCS B 41 35 福建省地方标准 DB35/T 19952021 禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断技术 Fluorescence quantitative PCR diagnosis of fowl hydropercardium-hepatitis syndrome 2021-08-17 发布 2021-11-17 实施 福建省市场监督管理局 发 布 DB35/T 19952021 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 疫病概述.1 5 设备、材料和试剂.2 6 样品的采集、保存和处理.2 7 样品中病毒
2、 DNA 提取.3 8 荧光定量 PCR 操作步骤.3 9 结果判定.3 10 测序.4 附录 A（规范性）试剂的配制及引物序列.5 附录 B（资料性）扩增产物参考基因序列和荧光定量 PCR 扩增曲线图.6 DB35/T 19952021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由福建省农业科学院提出。本文件由福建省农业农村厅归口。本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心。本文件主要起草人：施少华、陈珍、陈翠腾、叶洪、张体
3、银、郑腾、黄瑜、朱春华、傅光华、程龙飞、万春和、彭春香、刘荣昌、陈红梅、傅秋玲。DB35/T 19952021 1 禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断技术 1 范围 本文件规定了禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断技术的设备、材料和试剂，样品的采集、处理和保存，样品中病毒DNA的提取，荧光定量PCR操作步骤及结果判定的技术要求。本文件适用于禽心包积液-肝炎综合征的分子生物学诊断及流行病学监测。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 禽心包积液-肝炎综合征 fowl hydropercardium-hepatitis syn
4、drome；HHS 由禽腺病毒4型引起禽类的以心包积液、肝炎为特点的一种综合征。3.2 禽腺病毒 4 型 fowl adenovirus serotype 4；FAdV-4 引起禽心包积液-肝炎综合征的病原。3.3 循环阈值 cycle threshold；Ct 值 荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 疫病概述 禽心包积液-肝炎综合征（HHS），最早于1987年发生于巴基斯坦安卡拉地区。目前，该病呈现世界范围分布，多个国家、地区相继报道该病的发生，各地分离到的毒株略有差异，但大多为FAdV-4，且具有很强的致病性。2010年以来，我国多地发生了HHS，
5、并从发病鸡群中分离到FAdV-4。该病主要临床特征为心包充盈，心包内积有淡黄色液体或胶冻样物；肝脏呈现不同程度肿胀，质地较脆、易碎，有出血斑或出血点；肾脏肿大、质地较脆，有的呈现“花斑肾”。该病主要发生于35周龄肉鸡，1020周龄蛋鸡偶有发生，有报道鸭、鹅、鸽及野鸟也可发生该病。发病鸡在4 d后开始死亡，死亡期可持续7 d10 d，发病率和病死率分别为10%30%和20%75%。该病一年四季均可发生，以水平传播为主，也可垂直传播，感染鸡排毒期可长达9周，发病日龄越早，死淘率越高。DB35/T 19952021 2 5 设备、材料和试剂 设备 5.1 5.1.1 台式冷冻高速离心机（转速应12
6、000 r/min）。5.1.2 水浴锅或金属浴。5.1.3 微量可调移液器（量程分别为 100 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L）。5.1.4 荧光定量 PCR 仪。5.1.5 旋涡混合仪 材料和试剂 5.2 5.2.1 棉拭子稀释液：配比按照附录 A 的 A.1。5.2.2 组织稀释液：配比按照附录 A 的 A.2。5.2.3 10%SDS 溶液：配比按照附录 A 的 A.3。5.2.4 3 mol/L 醋酸钠缓冲液（pH5.2）：配比按照附录 A 的 A.4。5.2.5 75%乙醇：配比按照附录 A 的 A.5。5.2.6 荧光定量 PCR 检测用
7、引物和探针的序列、使用方法：配比按照附录 A 的 A.6。5.2.7 蛋白酶 K、Tris 饱和苯酚、酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）、无水乙醇：直接购买成品使用。5.2.8 Probe qPCR 试剂盒：应与荧光定量 PCR 仪相配套的探针 qPCR 试剂盒。5.2.9 PCR 反应管：与荧光定量 PCR 仪相配套的 PCR 反应管。5.2.10 阳性对照：含 FAdV-4 目的基因片段的质粒 DNA（拷贝数2.13104/L）。5.2.11 阴性对照：Nuclease-free Water。6 样品的采集、保存和处理 样品的采集 6.1 6.1.1 棉拭子样品的采样 将棉拭子插入咽喉或泄
8、殖腔旋转35次，取出放入盛有1.0 mL棉拭子稀释液的1.5 mL无菌离心管中。6.1.2 组织样品的采集 无菌采集病禽有明显病变的肝脏、脾脏等组织。样品保存 6.2 样品采集后应保存在2 8 条件下，24 h内送达实验室。超过24 h的应保存在-20 条件下，且时间不应超过7 d。如需长期保存，须保存在-70-80 条件下。样品的处理 6.3 6.3.1 棉拭子样品的处理 取出棉拭子样品，于旋涡混合仪上振荡15 s，4、5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。DB35/T 19952021 3 6.3.2 组织样品的处理 取组织样品，按质量体积比（1:5）加入组织稀释液进行匀浆
9、，转入1.5 mL无菌离心管中，反复冻融23次后，4、5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。7 样品中病毒 DNA 提取 常规方法提取 DNA 7.1 7.1.1 取 540 L 上清液，先加 60 L 10%SDS 溶液后，再加蛋白酶 K 至终浓度 50 g/mL，于旋涡混合仪上混匀 15 s，置 56 孵育 2 h。7.1.2 加入等体积 Tris 饱和苯酚，于旋涡混合仪上混匀 15 s 后，置 4、12 000 r/min 离心 15 min。7.1.3 离心后吸取上清液转移至 1.5 mL 无菌离心管（注意不要吸出中间层），加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），
10、颠倒混匀 15 s，静置 5 min 后，置 4、12 000 r/min 离心 15 min，吸取上清液转至其他无菌离心管中。7.1.4 重复 7.1.3 步骤 1 次。7.1.5 加入相当于上清液 1/10 体积的 3 mol/L 的醋酸钠缓冲液（pH5.2）、2 倍体积的无水乙醇，颠倒混匀 15 s，-20 沉淀 2 h。7.1.6 于 4 下 12 000 r/min 离心 15 min 后倾去上清液，加入 800 L 75%乙醇溶解沉淀物，置 4 下 12 000 r/min 离心 5 min 后吸尽残余液体；再以 75%乙醇溶解沉淀物 1 次，置 4 下 12 000 r/min离
11、心 5 min，吸尽残余液体；置 4 下 12 000 r/min 离心 5 s 后吸尽残余液体，室温静置 5 min。7.1.7 加入 50 L 灭菌双蒸水溶解沉淀物，冰浴备用。提取的 DNA 应于 2 h 内进行荧光定量 PCR 或保存于-20 条件下。商品化试剂盒提取 DNA 7.2 病毒DNA的提取，也可采用商品化DNA提取试剂盒提取。8 荧光定量 PCR 操作步骤 在PCR反应管中分别加入以下试剂：Probe qPCR mix 10 L，引物FAdV-4-F、FAdV-4-R各0.4 L，探针引物FAdV-4-P 0.8 L，模板DNA 2.0 L，加Nuclease-free Wa
12、ter至总体积20 L，混匀，离心5 s。将PCR反应管放入定量PCR仪，扩增反应条件：95 预变性2 min；95 变性10 s，60 退火30 s，共40个循环；最后保存于4。同时，设立阳性对照和阴性对照各至少一个。9 结果判定 阳性对照有典型的扩增曲线，且Ct值27；阴性对照无扩增曲线，且无Ct值；两者均符合，方可判定检测结果有效，见附录B的B.1。待检样品Ct值32时，且出现典型的扩增曲线，判为FAdV-4核酸检测阳性，见附录B的B.1。待检样品Ct值35时，或无典型的扩增曲线，判为FAdV-4核酸检测阴性，见附录B的B.1。待检样品32Ct值35时判为可疑，应重做；重做时待检样品Ct
13、值32判为FAdV-4核酸检测阳性，待检样品Ct值32判为FAdV-4核酸检测阴性。DB35/T 19952021 4 10 测序 必要时可对定量PCR产物进行测序，参考序列参见附录B的B.2。DB35/T 19952021 5 附录A （规范性）试剂的配制及引物序列 A.1 棉拭子稀释液 0.01 mol/L PBS缓冲液中添加青霉素（10 000 IU/mL）、链霉素（10 mg/mL）、庆大霉素（250 pg/mL）和制霉菌素（5 000 IU/mL），调节pH至7.27.4。A.2 组织稀释液 0.01 mol/L PBS缓冲液中添加青霉素（2 000 IU/mL）、链霉素（2 mg/
14、mL）、庆大霉素（50 pg/mL）和制霉菌素（1 000 IU/mL），调节pH至7.27.4。A.3 10%SDS 溶液 称量10 g十二烷基硫酸钠，加入90 mL灭菌双蒸水，小心搅拌，缓慢加热至水温在25 以上使之完全溶解。A.4 3 mol/L 的醋酸钠缓冲溶液 取800 mL水加入408 g三水醋酸钠，溶解后用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1 000 mL。A.5 75%乙醇 量取750 mL的无水乙醇加入250 mL的灭菌双蒸水。A.6 荧光定量 PCR 检测用引物序列 荧光定量PCR检测用引物序列为：a)正向引物 FAdV-4-F：5-CCCGATCTCAGTCAAATT-
15、3；b)反向引物 FAdV-4-R：5-TGCTAAACTTGTAACGGTC-3；c)探针引物 FAdV-4-P：5-FAM-AACGACAAAAACACCGCC-MGB-3。荧光定量PCR扩增片段为196 bp，引物和探针用双蒸水溶解至10 mol/L，保存于-20 备用。DB35/T 19952021 6 附录B （资料性）荧光定量 PCR 扩增曲线图和扩增产物参考基因序列 B.1 荧光定量 PCR 扩增曲线图 以建立的荧光定量PCR诊断技术对2份阳性样品和2份阴性样品进行检测，同时设阳性对照和阴性对照，结果见图B.1。标引序号说明：I-阳性对照；N-阴性对照；2-阳性样品；3-阳性样品
16、；4-阴性样品；5-阴性样品。图B.1 荧光定量 PCR 扩增曲线图 B.2 扩增产物参考基因序列 选择FAdV-4 GDMZ株（GenBank的登录号：MG856954）Hexon基因序列作为参考基因序列：cccgatctcagtcaaattaaactctacaccaacaacaccgccgcgaacgacaaaaacaccgccgtggctaacgccactaccaacttctacttcggcacggtaccctcctacgaaatcgatatcagcgctacccagaggcgcaactttatcatggccaacatcgccgagtatctgcccgaccgttacaagtttagc。