1、Technical regulation for detection of Elsinoe leucospila茶白星病原菌检测技术规程发 布湖南省市场监督管理局2022-05发布-0643湖南省地方标准ICSCCS 67.140.10B 35DB43/T 23322022 2022-08实施-06DB43/T 23322022 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 样品采集 1 5 形态检测 2 6 分子检测 2 附录 A（资料性）茶白星病的田间症状 4 附录 B（资料性）茶白星病菌的菌落、菌丝与孢子形态 5 附录 C（资料性）茶白星病菌基因序列片段
2、 6 参考文献 7 DB43/T 23322022 II DB43/T 23322022 III 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业农村标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南省茶叶研究所。本文件主要起草人：周凌云、杨辉、杨文波、向芬、刘红艳、李维、银霞、曾泽萱。DB43/T 23322022 IV DB43/T 23322022 1 茶白星病原菌检测技术规程 1 范围 本文件规定了茶白星病原菌
3、的术语和定义、样品采集、形态检测和分子检测。本文件适用于茶白星病菌-茶痂囊腔菌（Elsinoe leucospila）的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8302 茶 取样 SB/T 103141999 采样方法及检验规则 NY/T 3862 茶云纹叶枯病监测技术规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 样品采集 4.1 采样特征 4.1.1 发
4、生部位 茶白星病症状可见于 02000 m 海拔茶区的茶树嫩梢、成叶、老叶与花苞等茶树组织。4.1.2 初期症状 初期病斑为针尖大小的红褐色小点，随即围绕该点出现多个红褐色斑点呈卫星状分布，斑点直径生长至 2.5 mm 大小，红褐色圆形病斑边缘具有暗褐色至紫褐色隆起线，中间凹陷、平伏或凸起。4.1.3 后期症状 发病后期病斑由红褐色渐变为黑褐色，边缘凸起，中间白色，呈疮痂状，病斑呈数个至上百个连片分布，严重时病斑相互融合成不规则的大病斑。大病斑常呈黑色凸起，中间呈灰白色（见附录 A）。4.2 采样 采样量不得少于检验需要量的三倍。随机选取具有典型症状的茶枝，保湿剪切口后样品分装、贴标签（包括来
5、源、地点、采集人、日期等信息）。DB43/T 23322022 2 5 形态检测 5.1 材料与仪器 培养皿、枪头、三角瓶、玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种环、75酒精、3次氯酸钠、移液枪、酒精灯、超净工作台、培养箱、灭菌锅、天平。5.2 病原分离 选取有发病组织的样品，用无菌水洗净，从叶脉、茎秆或叶肉等组织的病健交界处切取约 2 mm2 mm 小块病组织，于 75乙醇中 5 s、3次氯酸钠溶液中 110 s、无菌水中清洗 3 次、晾干后置于直径 9 cm 的 PDA 培养基（200 g 马铃薯、20 g 葡萄糖、20 g 琼脂粉，蒸馏水定容至 1 L）平板上，再倒置于恒温培养箱中 24下黑暗
6、培养 7 d，待菌落长出形成孢子后，用琼脂平板单孢子挑取法进行单孢分离。5.3 病原菌落 茶白星病的病原为痂囊腔属（Elsinoe）的 E.leucospila，属于子囊菌。单孢分离的菌株，以 PDA 平板培养基在 24恒温培养箱中培养至稳定期并观察，该菌生长速度很慢，60 d 至 80 d 后菌落生长至稳定期。菌落初期为黄褐色，后期为红褐色，呈近圆形毡状，边缘有褶皱，边界光滑清晰，质地致密坚硬，中心位置丘状凸起，具粉红色粘稠状分生孢子堆，后期菌落边缘较薄，表面有时产生白色菌丝，并分泌色素等物质使培养基呈黄色或红色等颜色（见附录 B-1）。5.4 分生孢子 分生孢子在光学或电子显微镜下的形态。
7、成熟菌落的表面有大量分生孢子。光学或电子显微镜下观察，分生孢子单胞，椭圆形，半透明，大小为（2.06.5）m（1.02.5）m（见附录 B-2）。6 分子检测 6.1 材料与仪器 真菌基因组 DNA 提取试剂盒、琼脂糖，核酸染料、TAE 电泳缓冲液、DNA 分子量标准、PCR 仪、恒温培养箱、离心机、天平、高压灭菌器、恒温水浴锅、pH 计、电泳分析系统，实验室用水符合 GB/T 6682规定的要求。6.2 引物序列 表 1 茶白星病病原 PCR 检测引物 目标基因 引物名称 序列（5-3）扩增产物长度 ITS ITS-F TCCGTAGGTGAACCTGCGG 575 bp ITS-R TCC
8、TCCGCTTATTGATATGCC LSU LROR GTACCCGCTGAACTTAAGC 915 bp LR5 ATCCTGAGGGAAACTTC RPB2 5F GAYGAYMGWGATCAYTTYGG 1001 bp 7CR CCCATRGCTTGYTTRCCCAT 注：ITS 是内源转录间隔区(internally transcribed spacer)，LSU 是核糖体大亚基（large subunit rRNA），RPB2是 RNA 聚合酶 II 的第 2 大亚基(the second largest RNA polymerase subunit)的英文缩写。DB43/T 23
9、322022 3 6.3 操作步骤 取供试菌株菌丝 0.4 g 左右，采用真菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取 DNA 模板。配制 PCR 扩增体系：Taq DNA 聚合酶 0.25 L(5 U/l)，dNTPs 0.4 L，DNA 模板 1 L，应用 ITS、LSU 或 RPB2 的引物对：上下游引物（10 mol/L）各 1 L，ddH2O 补足至 50 L。设定反应条件：94预变性 4 min；94变性30 s，55退火 30 s，72延伸 90 s，共 35 个循环，最后 72延伸 10 min，4保存。电泳检测：设置以 ddH2O 代替 DNA 模板的空白对照，将 PCR 扩增产物用
10、1.2琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶经核酸染料染色后用紫外观察仪观察并照相。6.4 结果观察 以 DNA 分子量标准为参照，供检样品 PCR 产物电泳后出现预期大小的条带，判定为检测阳性，否则为阴性，切胶回收目的条带 DNA，对 PCR 产物进行核苷酸序列测定和同一性分析（附录 C）。DB43/T 23322022 4 附 录 A（资料性）茶白星病的田间症状 a,c：早期病斑；b,d：晚期病斑；e：叶脉病斑；f,g 茎秆病斑；h.花苞病斑（c,d,g 光学显微观察，标尺 2 mm）DB43/T 23322022 5 附 录 B（资料性）茶白星病菌的菌落、菌丝与孢子形态 附录 B-1 茶白星病菌菌落形
11、态 a：PDA 培养基上培养 10 d 的菌落，b：PDA 上生长 30 d 的菌落，c：生长于 PDA 达 60 d 的菌落，d：生长在 PDA 上80 d 的菌落 附录 B-2 茶白星病菌显微形态 a：茶叶病斑组织，b：发病茶叶组织中病菌菌丝簇，c：PDA 培养基上生长的病菌菌丝簇，d，e，f：病菌分生孢子（a-d 光学显微观察，标尺 10 m；e 和 f 扫描电子显微镜观察）DB43/T 23322022 6 附 录 C（资料性）茶白星病菌基因序列片段 1.Elsinoe leucospila-ITS（NCBI 登录号：MK312257）TGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAG
12、GGCCTCCTTCGGGAGCCCGAACTCCCCACCCTTTGCTGTTGCGAACAAGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCTCCCCTTCAAAACGGGGGGGGGACCGGGCCTCTGCGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTGTTAAAACAATGCAGTCGGAGTACAATCGTACAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGC
13、GCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGTCTAGGCCGGACCCCCGCGTCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCGAAACGTCAGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTCAAACCTTTACATTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATC 2.Elsinoe leucospila-LSU（NCBI 登录号：MK793761）GCTGCGG
14、GAGAGAGCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGCGTCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGATGCTATTGGGTTGCCACCGGTCTAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTATGTGACCGGCCAGGCGCCTTTTGTATAGCTCCTTCGACGAGTCGGGTTGTTTGGGAATGCAGCCCTAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGA
15、TCGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAAAAAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCAATCAGTCTCGACGGCGGCTGTTCGGCCTCTCTTCTGAGTGGTTTATTCAGTCGCCGCCGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCCGGATAAAGGCGTGGGGAATGTAGCTCCCTCGGGAGTGTTATAGCCCCGCGTGCAATACGGCCCGCCGGGACTGAGGTCCGCGCTCCGGTTAGGATGCTGGCGAAATGGTTGTAAGCGGCCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCT
16、AACATCTACGCGAGTGTTTGGGTGTCAAACCCATACGCGCAATGAAAGTGAACGGAGGTGGGAACCGCAAGGTGCACCATCGACCGATCCTGATGTCTTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCGTAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCTGCCGAAGTCCCCCTCCAGGATAAGAAAAA 3.Elsinoe leucospila-RPB2（NCBI 登录号：MK814962）AAAAACCAAGGATTAGCCTGGGACTCTCATGTCTCAGTCTTCGTCTCAAGTTTACTCAGCTCGTCCGCGACATAAGAACTAACTATCACGCTGTGTCGAGCAGGGCAAAGACTTCAATTTGACTCTGGCTGTCAAGTCAAATATCATC