1、ICS 65.020.30B40/49DB50重庆市地方标准DB 50/T 10442020无菌（Germ-free,GF）猪微生物学监测技术规范Technical Specification for Microbiological Monitoring of Germ-free Pig2020-10-10 发布2020-12-30 实施重庆市市场监督管理局发 布DB50/T 104420201目次前言.21 范围.32 规范性引用文件.33 术语和定义.34 妊娠母猪微生物学监测.45 无菌猪微生物学监测.46 饮水和日粮微生物学监测.67 隔离器和物品微生物学监测.7DB50/T 1044
2、20202前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。本标准由重庆市畜牧科学院提出。本标准由重庆市农业农村委员会归口。本标准主要起草单位：重庆市畜牧科学院。本标准主要起草人：葛良鹏、孙静、梁浩、刘作华、丁玉春、吴梦、黄勇。DB50/T 104420203无菌（Germ-free,GF）猪微生物学监测技术规范1范围本标准规定了无菌猪生产及使用过程中的妊娠母猪、无菌猪、饮水和日粮、隔离器和物品等微生物学监测技术要求。本标准适用于无菌猪生产和使用时微生物学质量控制。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用
3、文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 16551 猪瘟检疫技术规范GB/T 18090-2008 猪繁殖与呼吸综合诊断方法GB/T 18448.1-2001 实验动物体外寄生虫检测方法GB/T 18448.2-2008 实验动物弓形虫检测方法GB/T 18641 伪狂犬病诊断技术GB/T 18935-2003 口蹄疫诊断技术GB/T 21674-2008 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法SN/T 1559-2010 非洲猪瘟检疫技术规范SN/T 1919-2016 猪细小病毒病检疫技术规范NY/T 544-2015 猪流行性腹泻诊断技术NY/T 548-2015 猪传染性胃肠炎
4、诊断技术NY/T 678 猪伪狂犬病免疫酶试验方法NY/T 679 猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法3术语和定义下列术语与定义适用于本文件。3.1无菌猪 Germ-free(GF)pig利用现有检测手段，无可检出一切活的微生物（包括细菌、病毒）和寄生虫，能保证猪源性细胞、组织、器官研究的生物安全性和清晰的微生物背景的实验用猪，简称无菌猪。3.2悉生猪Gnotobitoic(GN)pig以无菌猪为对象，通过微生物移植技术构建出只含有特定菌群，并始终在可屏蔽外界微生物条件下生活的实验用猪，可分为单一菌株移植悉生猪和组合菌群移植悉生猪。DB50/T 1044202043.3隔离环境 Isolatio
5、n environment与外界完全隔离，可阻断任何外源微生物侵入的封闭空间。3.4屏障环境 Barrier environment屏障环境应作为隔离环境的第一层保障，用于放置和使用无菌隔离器。4妊娠母猪微生物学监测妊娠猪应未注射猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗，外观健康、无异常；应排除经胎盘垂直传播的四种疾病，包括猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪细小病毒病。病原筛查方法参照 GB/T16551、GB/T18641、NY/T679 和 SN/T 1919-2016 执行。5无菌猪微生物学监测5.1采样5.1.1 采样管的准备宜采用螺帽盖的采样管，内部自带 1 支拭子。也可通过带螺帽盖的离心管
6、和 1 支棉签自制而成。采样管选择在保质期内的、且包装完好的无菌采样管（宜经过环氧乙烷灭菌处理），或提前高温高压灭菌处理。采样当天，无菌采样管放入屏障设施的传递窗内，并紫外光照 30min 及以上。5.1.2 采样管转入隔离器在保持无菌猪饲养隔离器传递通道内部密封罩密封状态下，取下传递通道外侧密封罩，将无菌采样管放入传递通道，密封外侧密封罩。采用 1.5%-2%新制的过氧乙酸从传递通道外侧密封罩上的消毒孔，对传递通道内部空间进行喷雾消毒。喷雾时间不宜低于 5min。密封消毒孔，并等待 30min 以上。通过无菌猪饲养隔离器操作手套，从隔离器内部取下传递通道内侧密封罩，将无菌采样管移入隔离器内，
7、重新罩上传递通道的内侧密封罩。5.1.3 采样过程根据实验要求用拭子采集样本（如猪肛门拭子、鼻拭子或新鲜粪便），立即装回采样管，并盖紧螺帽盖。5.1.4 采样管转出隔离器取下传递通道内部密封罩，将采样管转到隔离器的传递通道内部，罩好内部密封罩，再打开隔离器传递通道的外部密封罩，将采样管取出，重新罩上外部密封罩。采用 1.5%-2%新制的过氧乙酸从传递通道外部密封罩上的消毒孔，对传递通道内部空间进行喷雾。喷雾时间宜不少于 5min。5.2细菌监测DB50/T 1044202055.2.1 培养及观察将采集的样本分别接种于血琼脂培养基、脑心浸液肉汤和硫乙醇酸盐培养基，分别在需氧和厌氧条件下 37培
8、养 48h 及以上。无菌条件下，取培养后的样本，涂片、固定、革兰染色后显微镜下检查菌体及形态。每个隔离器，宜平行检测重复 3 次。5.2.2 判定标准固体培养基上，应无任何可见菌落；液体培养基内，应无浑浊、无沉淀，且镜检无细菌菌体。5.2.3 监测频率宜每周检测 1 次。5.3真菌监测5.3.1 培养及观察将采集的样本接种于大豆酪蛋白固体培养基，分别在 20、28和 37下需氧培养 48h 及以上。每个隔离器，宜平行检测重复 3 次。5.3.2 判定标准固体培养基上，应无任何可见菌落，且镜检无真菌菌体。5.3.3 监测频率宜每周检测 1 次。5.4无菌猪病毒监测5.4.1 监测指标应对 4 种
9、垂直传播病毒进行监测，包括猪瘟病毒、细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒。应对 5 种猪常见病毒进行监测，包括口蹄疫病毒 O、猪圆环-2 型病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、非洲猪瘟病毒。5.4.2 指标检测标准无菌猪的 9 种病毒指标及其检测标准见表 1。表 1 9 种病毒指标及检测标准病毒指标检测标准猪瘟病毒GB/T 16551-2008猪繁殖与呼吸综合征病毒按照GB/T 18090-2008猪细小病病毒SN/T 1919-2016DB50/T 104420206猪伪狂犬病病毒NY/T 678-2003猪圆环-2 型病毒GB/T 21674-2008猪口蹄疫病毒 OG
10、B/T 18935-2003猪流行性腹泻病毒NY/T 544-2015猪传染性胃肠炎病毒NY/T 548-2015非洲猪瘟病毒SN/T 1559-20105.4.3 判定标准上述 9 种病毒不应检出。5.4.4 监测频率宜每月检测 1 次。5.5无菌猪寄生虫监测5.5.1 监测指标对猪弓形虫、猪血虱、猪疥螨 3 种猪寄生虫指标进行监测。5.5.2 指标检测方法猪弓形虫检测按照 GB/T 18448.2-2001 执行，猪血虱、猪疥螨按照 GB/T 18448.1-2001 执行。5.5.3 判定标准不应检出任何寄生虫。5.5.4 监测频率宜每周检测 1 次。6饮水和日粮微生物学监测6.1饮水微
11、生物学监测6.1.1 采样与培养无菌条件下，取冷却的灭菌纯水 1mL，接种到大豆酪蛋白固体培养基，分别在 28和 37需氧培养 24h。宜平行检测重复 3 次。DB50/T 1044202076.1.2 判定标准不应检出任何细菌。6.2日粮微生物学监测6.2.1 采样与培养按照日粮总量的 5%进行抽样检查。无菌条件下，每袋无菌猪日粮取 25g，加入 25mL 灭菌水，充分混匀，静置 10min。取上清液 1mL，分别接种到大豆酪蛋白固体培养基、脑心浸液肉汤和硫乙醇酸盐培养基，在分别在需氧和厌氧条件下 37培养 72h 及以上。无菌条件下，取培养后的样本，涂片、固定、革兰染色后镜检。宜平行检测重
12、复 3 次。6.2.2 判定标准不应检出任何细菌。7隔离器和物品的微生物学监测7.1隔离器的微生物学监测7.1.1 隔离器检测前的准备隔离器的准备按照 CQDB2018-0005 要求进行。准备完成后并运行 24h 以上，利用无菌拭子对隔离器内部表面擦拭采样，装管密封后无菌传出。7.1.2 培养超净工作台内，将采样拭子分别接种到大豆酪蛋白固体培养基、脑心浸液肉汤和硫乙醇酸盐培养基，分别在需氧条件下 28和 37培养 72h 及以上。无菌条件下，取培养后的样本，涂片、固定、革兰染色后镜检菌体。7.1.3 判定标准不应检出任何细菌。7.2隔离器内物品的微生物学监测7.2.1 采样与培养对传入的物品表面充分擦拭采样并装管，传出隔离器。超净工作台内，将采样拭子分别接种到大豆酪蛋白固体培养基、脑心浸液肉汤和硫乙醇酸盐培养基，在分别在需氧条件下 28和 37培养 72h 及以上。无菌条件下，取培养后的样本，涂片、固定、革兰染色后镜检。7.2.2 判定标准不应检出任何细菌。_