1、 ICS 65.020.30 B 43 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 23942015 猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的 制备和鉴定 Regulation of preparation and identification of induced pluripotent stem cells from pigs 2015-12-15 发布 2016-01-25 实施 吉林省质量技术监督局 发 布 DB22/T 23942015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由吉林省标准研究院提出。本标准由吉林省畜牧业管理局归口。本标准起草单位：吉林省标准研
2、究院。本标准主要起草人：赵慧明、张学明、李子义、唐博、崔娜娜、王琪、杨磊。DB22/T 23942015 1 猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的制备和鉴定 1 范围 本标准规定了源于猪胎儿成纤维细胞的猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的工作区条件、主要仪器设备、清洗与消毒、试剂及液体配制、猪iPSCs的制备、警示、标签及其他要求。本标准适用于猪iPSCs在畜牧业生产实践、基础医学研究和临床医疗等方面的应用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66
3、82 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 15562.2 环境保护图形标志 固体废物贮存（处置）场 GB/T 24863 畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程 HG/T 3935 哺乳类动物细胞培养基 NY/T 1900 畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 SN/T 2330 化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 诱导多潜能干细胞 induced pluripotent stem cells(iPSCs)通过转染特定的转录因子（如经典的胚胎特异性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4组合），从已分化体细胞（如成纤维细胞）重编程而
4、获得的多潜能干细胞。3.2 猪胎儿成纤维细胞 porcine fetal fibroblast(PFF)从妊娠25-30天猪胎儿中，去头、尾、四肢、骨骼、内脏后，消化分离获得的有良好增殖能力的细胞。3.3 饲养层细胞 feeder layer cell 将动物胎儿成纤维细胞经丝裂霉素C处理后，失去分裂增殖能力的活细胞。3.4 拟胚体 embryoid body 釆用悬滴法培养，将干细胞或iPSCs克隆消化成单细胞，检测其体外发育分化能力的方法。3.5 畸胎瘤 teratoma DB22/T 23942015 2 采用皮下注射法，将干细胞或iPSCs注射到免疫缺陷鼠皮下组织中，在SPF级条件下饲
5、养，被注射细胞在体内形成的含三胚层组织结构的瘤体组织。4 工作区条件 4.1 工作区域一般由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室、SPF 实验动物饲养设施等组成，内部设备条件按照 GB/T 24863 和 SN/T 2330 执行。4.2 缓冲间应不小于 3 m2，并设有更衣柜和紫外灯；紫外灯的强度1.5 W/m3，紫外灯管距地面不应超过 2.5 m，每次照射时间 30 min 以上。4.3 无菌室的最低标准应达到万级，并配备通风设备。5 主要仪器、设备 超净工作台、生物安全柜、冰箱、液氮生物容器、离心机、CO2培养箱、纯水装置、高压蒸汽灭菌器、电子天平、倒置显微镜、荧光显微镜、PCR仪、荧光定
6、量PCR仪、-80超低温冰箱。6 清洗与消毒 所用玻璃器皿和金属器材的清洗与消毒按照GB/T 24863执行。7 试剂及液体配制 各种使用液均用去离子水配制，充分溶解，立即用0.22 m滤膜滤过除菌，除特殊说明，均分装贮存于-20下备用，并执行GB/T 24863和NY/T 1900。包括：水、DMEM(dulbeccos modified eagle medium)培养基、青-链霉素、无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶-EDTA、冻存液、丝裂霉素C、LB培养基、293细胞培养基、转染培养基、Opti-MEM、ES培养基、条件性培养液、IV型胶原酶（见附录A.1A.14）。8 猪 iPSC
7、s 的制备 8.1 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备 将见栓12.5 d的SPF级（无特定病原体）ICR品系孕鼠用脱颈法处死，分离、培养胎儿成纤维细胞，原代细胞生长至约90%密度时进行传代、丝裂霉素C处理、清洗、消化、计数、冻存。（具体步骤见附录A.15）。8.2 猪胎儿成纤维细胞制备 8.2.1 取材 无菌手术取出妊娠25 d30 d的猪子宫，两端扎紧后运回实验室，将子宫整个浸泡于75%的酒精中消毒30 s，将消毒后的子宫送入细胞培养室中，剪开子宫，取出羊膜完整的胎儿置于75%的酒精中浸泡30 s，取出用PBS洗3次后移入生物安全柜中。用剪刀将胎儿去除头、尾、四肢、内脏、脊椎骨及肋骨，用PBS冲
8、洗剩余组织，将组织剪碎至组织块直径均小于1 mm。8.2.2 消化 DB22/T 23942015 3 加入少量PBS，将组织块吸出置于50 ml离心管中，加入10 ml 0.25%胰酶-EDTA溶液，置于37培养箱中消化15 min，间隔2 min3 min吹打一次。消化结束后加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM终止消化，轻轻吹打将细胞重悬，使用200目筛网过滤，收集滤液，300 g离心8 min，弃净上清液。8.2.3 培养 加入10 ml 含10%FBS的DMEM将细胞重悬，移入2个T-75培养瓶中，每瓶再加入10 ml培养液，置于培养箱中，37.5、5%CO2条件培养培养
9、，24 h后换液，去除悬浮的细胞。待细胞铺满培养瓶面积的80%90%（2 d3 d），可将细胞进行冻存或传代。8.3 诱导 iPSCs 质粒制备 8.3.1 转化 将包含4种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4，参见附录）和绿色荧光蛋白（GFP)的逆转录病毒质粒（pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc和pMX-GFP)及辅助质粒Vsvg分别转入DH5感受态细菌（见附录A.16）。8.3.2 筛选 向每管细菌中加入液体LB培养基900 l，置于恒温摇床中37下120 rpm震荡45 min；从每管中吸取100 l液体，均匀滴于含有氨苄青霉素的LB
10、固体培养基上，使用涂菌棒涂匀后，置于37生化培养箱中培养12 h。出现明显菌落后，使用小枪头挑取菌落置于5 ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37、200 rpm震荡12 h。8.3.3 质粒提取和浓缩 将上述菌液加入到200 ml新鲜含氨苄青霉素液体LB培养基中，37下200 rpm震荡12 h，用OMEGA无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒；测提取质粒的浓度，用冰乙醇沉淀法（见附录A.17）浓缩质粒，使质粒浓缩达到1 g/l以上，标记后置于-20冰箱保存备用。8.4 逆转录病毒制备 8.4.1 293 细胞培养 用T-75培养瓶和293细胞培养基，在37.5、5%CO2条件下培养293GT
11、细胞，培养第2 d，待细胞生长至60%70%密度时吸出旧培养液，加入10 ml转染培养基置于培养箱中备用。8.4.2 转染 将pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc、pMX-GFP和Vsvg质粒各10 g加入1 ml Opti-MEM中混匀；将50l Lipofectamine 2000转染试剂加入1 ml Opti-MEM中混匀，室温孵育5min；将上述两种溶液混匀并室温孵育20 min。将上述溶液加入293GP细胞中晃匀后，置于培养箱中，37.5、5%CO2条件培养，每2 h晃动一次培养瓶，培养6 h后吸去培养液，换为12 ml新鲜293细胞培养液培养。8
12、.4.3 逆转录病毒液收集 培养第4天，收集293GT细胞培养液，使用0.45 m滤器过滤，标记好后置于4冰箱保存；再向293GT细胞中加入12 ml 293细胞培养基继续培养，第5天再次收集细胞培养液，使用0.45 m滤器过滤后与第4天收集的上清混匀后置于4冰箱保存备用。DB22/T 23942015 4 8.5 猪 iPSCs 的诱导 猪 iPSCs 的诱导过程如下：a)D0 将 3 代以内猪胎儿成纤维细胞培养至 90%汇合时，使用 0.25%胰酶-EDTA 消化，制备成单 细胞悬液，以每孔 2l06个的密度接种到 6 孔板上培养，此时记为零天（D0，以此类推）。b)D1 待细胞长至 80
13、%-90%汇合，每孔换 2 ml 新鲜培养液，同时每孔加入 5 种病毒液（Oct4、Klf4、Sox2、C-myc、GFP)，每种病毒各 2 ml，置于培养箱中 37.5、5%CO2条件培养。c)D2 弃去培养液，每孔中加入 2 ml 新鲜培养液，同时每孔再加入 5 种病毒液（同前），每种 病毒各 2 ml，置于培养箱中 37.5、5%CO2条件培养。d)D3 弃去培养液，每孔加入 2 ml 新鲜 ES 培养基按照 SN/T 2330、HG/T 3935 执行，置于 培养箱中 37.5、5%CO2条件培养。e)D4 复苏饲养层细胞，于 100 mm 培养皿中培养。f)D5 将感染后的细胞用 0
14、.25%胰酶 EDTA 消化，传至铺有饲养层的 100 mm 培养皿中，加入 9 ml ES培养液于37.5、5%CO2条件下培养。此后每天换一次培养液，于D10后换为条件性培养液培养。每日观察细胞变化，直至出现 ES 形态的细胞克隆。8.6 猪 iPSCs 的收集与传代培养 在体视显微镜下挑取形态较好，边界清晰的原代iPSCs克隆，使用玻璃针（制作见附录A.18）将其边缘与饲养层细胞分开，从一端轻轻地将克隆推起，将克隆吸出，轻轻吹打使其分散成若干较小的克隆，置于铺有饲养层的六孔板中扩大培养。8.7 猪 iPSCs 的鉴定 8.7.1 碱性磷酸酶染色 用碱性磷酸酶染液对所获细胞克隆进行染色，阳
15、性克隆呈紫红色或红色（见附录A.19）。8.7.2 免疫荧光染色分析 8.7.2.1 一抗孵育 克隆细胞经洗涤、固定、透化、封闭后，向各培养孔中分别加入200 l用1%BSA溶液以1:100的比例稀释的一抗（兔抗-Oct4:ab18976;兔抗-Nanog:ab80892、兔抗-Rex1:ab50828、鼠抗-SSEA-4:ab16287），放入培养箱中37孵育3 h；PBS洗涤3次，每次5 min。8.7.2.2 二抗孵育 将一抗溶液吸尽，PBS洗涤3次，每次5 min；每孔中加入200 l 用1%BSA溶液以1:400比例稀释的相应二抗（Alexa Fluor 488 goat anti-
16、rabbit、Alexa Fluor 568 goat anti-mouse），避光37孵育1.5 h。8.7.2.3,-二脒基-苯基吲哚（DAPI）染色 将二抗溶液吸尽，避光PBS洗涤3次，每次5 min。每孔中加入200 l DAPI染色液（D9542，40 mg/mL DAPI原液1:1000稀释于PBS中，避光），37避光孵育30 min。8.7.2.4 观察、拍照分析 DB22/T 23942015 5 将培养板置于荧光显微镜下观察、拍照分析。猪iPSCs克隆均呈Oct4、Nanog、Rex1阳性，为绿色荧光；也呈SSEA-4阳性，为橙色荧光。8.7.3 外源基因表达分析 8.7.3.1 总 RNA 提取 使用1 mg/ml的IV型胶原酶将iPSCs克隆从饲养层上消化下来，将其与饲养层细胞分离，收集到无RNA酶1.5 ml离心管中Trizol法提取总RNA（见附录A.20）。8.7.3.2 RT-PCR 反应及分析 用BioRTcDNA第一链合成试剂盒获得cDNA；以该cDNA为模板，用目的基因特异性引物（Oct4:F-gtcgccagaagggcaaac,R-cagggtg