1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 9 9-2 0 0 3棉花中转基因成分定性P C R 检测方法P r o t o c o l o f t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n f o r d e t e c t i n g g e n e t i c a l l y m o d i f i e d c o mp o n e n t s i n c o t t o n2 0 0 3-0 3-1 7 发布2 0 0 3-0 9-0 1实施中华人民共和国*国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局仇 IJS
2、 N/T 1 1 9 9-2 0 0 3前言本标准的附录A为资料性附录.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人:郑文杰、刘垣、唐丹舟、杨绍勇、何霖.本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 9 9-2 0 0棉花中转基因成分定性P C R 检测方法1 范 围 本标准规定了抗鳞翅目昆虫棉花中转基因成分的定性 P C R检测方法。本标准适用于抗鳞翅目昆虫棉花S G K3 2 1,S G K 9 7 0 8,G Kl,GK 2,G K3,G K 5,G K1 2,G K 1 9,G K2 2,G K 9 5-1
3、(晋棉2 6 号)、B o l l g a r d(保铃棉)中转基因成分的定性P C R 检测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和实验方法 S N/T 1 1 9 3 基因分析检测实验室技术要求 S N/T 1 1 9 4 植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法 S N/T 1 2 0 4 植物及其加工产品中
4、转基因成分实时荧光 P C R定性检验方法术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3.1 转签因 t r a n s g e n e 将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能 D N A序列，通过各种导人手段，使其在该物种中进行表达，以便该物种获得新的品种特征。3.2 聚合酶链式反应 p o l y m e r i s e c h a i n re a c t i o n(P C R)模板基因序列先经高温变性成为单链，在DN A聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板 D N A两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在 D N A聚合酶的作
5、用下以四种脱氧核糖核酸(d N T P)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。3.3缩略语3.3.1 P C R:p o l y m e r i s e c h a i n r e a c t i o n,聚 合酶 链式反 应，简称P C R.3.3.2 D NA:d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d，脱氧核糖核酸.3.3.3 d N T P:d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e，脱氧核昔三磷酸.3.3.4 d
6、 AT P:d e o x y a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e，脱氧腺昔三磷酸。3.3.5 d C T P:d e o x y c y t i d i n e t r ip h o s p h i t e，脱氧 胞昔三 磷酸。3.3.6 d G T P:d e o x y g u a n o s i n e t r ip h o s p h a t e，脱氧鸟昔三 磷酸.3.3.7 d T T P;d e o x y t h y m i d i n e t r ip h o s p h a t e，脱氧胸昔三磷酸。1S N/T 1 1 9 9
7、-2 0 0 33.3.8 d UT P:d e o x y u r id i n e t r i p h o s p h a t e,脱氧尿营三磷酸.3.3.9 b y:b a s e p a i r,碱基对.3.3.1 0 E D T A.e t h y l e n e d ia m i n e t e t r a a c e t i c a c id，乙二胺四乙酸.3.3.1 1 T a q.T h e r m u s a q u a t i c u，水生热栖菌。3.3.1 2 T r i s:t r i s(h y d r o x y m e t h y l)a mi n o m e
8、t h a n e，三(羚甲基)氨基甲烷。3.3.1 3 T E:Tr i s-C I,E D T A缓冲液.3.3.1 4 C a M V 3 5 S:3 5 S p r o m o t e r f r o m c a u l i f l o w e r m o s a ic v i r u s，花椰菜花叶 病毒3 5 S 启动 子.3.3.1 5 N P T I I:n e o m y c i n-3 -p h o s p h o t r a n s f e r a s e g e n e，新霉素-3,-磷酸转移 酶基因.3.3.1 6 N O S:t e r m i n a t o r
9、o f n o p a l i n e s y n t h a s e g e n e,胭脂碱合成酶 基因 终止子。3.3.1 7 C r y I A(b)-C r y I A(c),a s y n t h e t ic g e n e e n c o d e s 6 0 8 a m i n o a c i d s,i n s e c t ic i d a l-a c t i v e t r u n c a t e dp r o d u c t i d e n t i c a l t o t h a t o f c r y I A(b)g e n e a n d c r y I A(c)g e
10、 n e o f B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s s u b s p,Ku r s t a-k i s t e a i n HD-1 a n d HD-7 3 苏云金芽抱杆菌杀虫毒蛋白。r y I A(b)和:r y I A(c)的合成基因.3.3.1 8 C r y I A(c):a s y n t h e t i c g e n e e n c o d e s i n s e c t i c id a l-a c t i v e t r u n c a t e d p r o d u c t i d e n t i c a l t o t
11、 h a t o fc r y l A(c)g e n e o f B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s s u b s p,K u r s t a k i s t e a i n H D-7 3 苏云金芽抱杆菌杀虫毒蛋白c r y l A(c)的合成基因。3.3.1 9 G U S:b e t a-g l u c u r o n i d a s e g e n e,爵 葡萄搪昔酸酶基因。3.3.2 0 1 8 S r D NA:1 8 S r i b o s o ma l D NA g e n e,1 8 S 核糖体D NA基因。防污染措施检测过
12、程中防止交叉污染的措施按照S N/T 1 1 9 3中的规定执行。抽样和制样5，1 取样 按照S N/T 1 1 9 4 中 规定的 方法执行。5.2制样 称取约1 0 g 棉花样品，在经 1 2 1 C,3 0 m i n 高压消毒处理过的 研钵中加人液氮快速研磨至样品粉末颗粒约0.5 mm大小，快速装人1.5 ml的离心管中，于一2 0 保存。6 测定方法6.1 原理 样品经过提取 D N A后，针对转基因植物所插人的外源基因的基因序列设计引物，通过 P C R技术，特异性扩增外源基因的D N A片断，根据 P C R扩增结果，判断该样品中是否含有转基因成分.6.2 试剂和材料 除另有规定
13、外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为 按照G B/T 6 6 8 2 规 定的 一级水。6.2.1 引物根据表 1 的序列进行引物合成，加水配制成 1 0 0 i s mo l/I储存，直接用于P C R测试的引物浓度为 5 K m o t/I。其中外源基因的有关信息参见附录A,表 1 检测转基因棉花内、外源基因的引物序列被 检 测 基 因基 因来 源引物序列扩增片段长度/b y退火温度/1 8 S r DN A内源5 -t c t-g c o-c t a-t e a-a c t-tt r g a t-g g t-a-3 5 -a a t-t tg-c g c-g c c-t g c-tg e
14、-c t t-c c t-t-3 1 3 75 4C.MV 3 5 S外 源5 -g c t-c c t-a c a-a a t-g c r a t r a-3 5 -B e t-a g t-g g g-a t t-g t g-c g t-c a-3 1 9 55 4S N/T 1 1 9 9-2 0 0 3裹 1(续)被 检 侧 基 因荟因来薄引 物 序列扩增片段长度/b p退火温度/N O S外 源5-g a a-t c r t g t-t9 r c g g-t c t-tg-3 5-t t a-t c r t a g-t t t-g c g-c g r t a-3 1 8 05 4G U
15、 S外 源5 -t c a-g c g-c g a-a g t-c t t-t a t-a,3 5-t t r a g t-t c g-t t g-t t r a c a-c a-3 2 1 05 4N P T I I外 源5-a c o-tg t-c c g-g t g-c c r t g a-a t g-a a r t g r 3 5-g c o-a t g-a tg-g a t-a c t-t t r t c g-g c a-g g a-g r 3 1 9 65 4C r y l A(b)-Cr y l A(c)外 源5-g t t-c g t-t c t-c g g-a c t-a g
16、 t-t g-3 5-g g a-g a g-c t g-g g t-t a g-t a g-g a-3 21 55 4Cr y l A(c)外 源5-g t t-c c a-g c t-a c a-g c t-a c o-tc r 3 5-c c a-c t a-a a g-t t t-c t a-a c a-c c o-a o-3 1 1 96 06.2.2 1 m o l/L Tr i s-H C 1 缓冲液(p H8.0):称取 1 2 1.1 g三经甲基氨基甲烷(Tr i s),溶于8 0 0 mL水中，搅拌，加人浓盐酸4 2 mL，冷却至室温，用稀盐酸准确调节 p H至 8.0，加水定容至 工L，分装后高压灭菌备用。6.2.3 0.5 mo l/L E D T A(p H 8.0):在 8 0 0 mL水 中加 人 1 8 6.1 g二水 乙 二胺 四 乙酸二 钠(N a,-E D T A M O)，用磁力搅拌器剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液 p H值至8.0(约需2 0 g氢氧化钠颗粒)，然后加水定容至 1 L，分装后高压灭菌备用。6.2.4 D N A抽提缓冲液:量取 1