1、N Y/T 7 1 3-2 0 0 3前言 本标准修改采用I S O 5 5 6 2-2;1 9 9 9 香荚兰测试方法)(英文版)。本标准根据 I S O 5 5 6 2-2:1 9 9 9 重新起草。在附录A中列出了本标准章条编号与I S O标准5 5 6 2-2:1 9 9 9 章条编号的对照一览表。考虑到我国国情，在采用 I S O 5 5 6 2-2:1 9 9 9 时，本标准做了一些修改。有关技术性差异已编人正文中并在它们所涉及的条款的页边空白处用垂直单线标识。在附录B中给出了这些技术性差异及其原因的一览表以供参考。本标准的附录 A、附录 B均为资料性附录。本标准由农业部农垦局提出
2、。本标准起草单位:农业部热带农业产品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人:彭黎旭、方佳、吴莉宇、贺利民、冯信平、王明月、刘洪升。N Y/T 7 1 3-2 0 0 3香 草 兰豆英 中香兰素 的测定范围 本标准规定了 属于V a n i l l a f r a g r a n s(S a l i s b u r y)A m e s 和、y n.V a n i l l a p l a n i f o l i a A n d r e w s 种的香草兰中香兰素测定方法。本标准适用于香草兰豆英、切段和粉末中香兰素的测定。本标准不适用于香草兰豆英抽提物中香兰素的测定。本标准描述了分析香兰素的三个分析
3、方法:a)高效液相色谱法;b)紫外分光光度法;c)气相色谱法。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日 期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 1 2 8 0 6 实验室玻璃仪器 单标线容量瓶3 高效液相色谱法(仲裁方法)3.1 原理 试样进行抽提和稀释，加人内标物，用高效液相色谱法(H P L C)分离，再用紫外检测器测定香兰素的含量。3.2 试剂 分析纯试剂、蒸馏水、去离子水或相等纯度的
4、水。3.2.1 乙醇,9 5%(体积分数)。3.2.2 甲醇。3.2.3 磷酸溶液:c(H 3 P 0 4)=0.0 1 m o l/L,3.2.4 流动相:用 2 5 份甲醇(3.2.2)与 7 5 份稀磷酸(3.2.3)混合。用膜(3.3.3)过滤、脱气。3.2.5 香兰素(4-经基一 3 一 甲氧基苯甲醛)为对照标样，纯度大于9 9%.3.2.6 内标物:乙酞水杨酸，纯度大于9 9%03.2.7 香兰素储备液:称取一定量的香兰素 3.2.5),精确至。.0 0 1 g。用流动相配制成为浓度为1 g/L的标准储备液。3.2.8 工作溶液 用流动相(3.2.4)稀释储备液(3.2.7)，获得
5、工作溶液，使工作溶液的浓度符合 3.2.8.1 中的要求。香兰素工作溶液浓度为。.1 g/I，可在4 下暗处保存不超过1 0 天。3.2.9 内标物溶液 将乙酞水杨酸(3.2.6)溶解于流动相(3.2.4)中，使其浓度为。.6 g/L，称量时精确至0.0 0 1 g.注:内标浓度应与样品溶液中香兰素浓度基本一致.3.3 仪器3.3.1 气密研磨器。1N Y/T 7 1 3-2 0 0 33.3.23.3.31 3.4单标容量瓶，容量为1 0 0 m L和2 0 0 m L，符合G B/T 1 2 8 0 6 的要求。过滤膜，孔径为0.4 5 p m.连续型索氏抽提仪，由下列部件组成(见图1).
6、图 1 连续型索氏抽提仪 -1 2 5 m L索氏抽提器。冷凝器。-2 5 0 m L磨口 烧瓶。热源:带有滑动变阻器或其他控热方式的电热套或油浴。3.3.5 高效液相色谱仪:紫外检测器;进样装置;色谱柱:C,，硅胶柱，5 p m-1 0 p m粒径。3.3.6 注射器:用于高效液相色谱。3.3.7 分析天平，精确度为0.0 0 1 g.3.4 试样的制备 将样品(香草兰豆荚、切段或香草兰粉)研磨并使之充分混匀。3.5 称样 称2 0 g已制备好的样品，准确至0.0 0 1 g,3.6 抽提 在抽提仪器(3.3.4)中用大约2 0 0 m L乙醇(3.2.1)抽提试样(3.5)1 6 h，即溶
7、剂进行2 5 次3 0 次循环。每一 1 0 0 g 豆荚用 1 L溶剂抽提。将抽提物转移至一个 2 0 0 m L的容量瓶(3.3.2)中。用少量的乙醇清洗抽提仪器中的烧瓶数次，并将洗出液加人容量瓶中，乙醇定容并混合均匀。用流动相稀释该溶液 1 0 倍。2N Y/T 7 1 3-2 0 0 33.7 分析步骤3.7.1 色谱操作条件 流动相(3.2.4)流速大约为 1 m L/m i n，在3.3.5 规定的条件下室温进行分析。3.7.2 校准3.7.2.1 对照标准品和内标物分别进样，然后两者混合起来进样。调整操作条件使内标和样品峰的分辨率大于1.3.7.2.23.7.2.3面积。经过膜(
8、3.3.3)过滤后 3.6 中制备的样品上机测定。用1 0 m L内 标物与1 0 m L 3.2.7 所得到的标准溶液混合。用膜过滤上机进样测定峰高或峰校正因子(k)由式(1)给出。m;X h,m,X 凡 。(1)式 中:k;待测定的组份中组份 i 的响应系数;m上机溶液中组份i 中的质量，单位为毫克(m g);m,上机溶液中 内 标物的 质量，单位为毫克(m g);h;组份 z 的峰高度，单位为厘米(c m);凡内标物的峰高度，单位为厘米(c m).注:式中峰高可由其峰面积代替。3.7.3 测定3.7.3.1 用 1 0 m L内标物与1 0 m L 根据3.6 制备的样品溶液混合。用膜过
9、滤。3.7.3.2 在 3.7.2.3 规定的条件下将 3.7.3.1 所得到的溶液进样。待测定的物质的质量用式(2)计算:k;X h;X m,m;=h _,。.。.(2)式中，各符号的含义与3.7.2.3中的相同。注:式中的峰高可由其峰面积代替4 紫外分光光度法4.1 原理 试样中所含的香兰素用乙醇抽提，用紫外分光光度法测定乙醇溶液中的香兰素含量。4.2 试剂 分析纯试剂、蒸馏水、去离子水或者相同纯度的水。4.2.1 乙醇,9 6 0 0(体积分数)。4.2.2 氢氧化钠溶液，c(N a O H)=1 m o l/L o4.2.3 香兰素(4-经基一 3 一 甲氧基苯甲醛)。4.3 仪器4.
10、3.1 气密研磨器。4.3.2 1 0 0 m L,2 5 0 m L 单标容量瓶，符合G B/T 1 2 8 0 6 的要求。4.3.3 1 0 mL,2 0 mL和 2 5 mL移液管。4.3.4 干燥器。4.3.5 索氏抽提仪(3.3.4),4.3.6 分光光度计。N Y/T 7 1 3-2 0 0 34.3.7 样品池，光路长度为 1 c m,4.3.8 称量瓶，容量为2 5 m l-，带有气密的塞子。4.3.9 分析天平，精确度为0.0 0 1 g,4.4 程序4.4.1 香兰素比吸光度的测定4.4.1.1 标准溶液的制备 在称量瓶(4.3.8)中称取在干燥器(4.3.4)中干燥好的
11、香兰素(4.2.3)约3 0 m g，精确至。0 0 1 g.将其溶于约2 0 m l，的乙醇(4.2.”中，转移至一个2 5 0 m L的容量瓶中。用乙醇冲洗称量瓶数次，并将其倒人容量瓶中，用乙醇定容并摇匀(溶液A1)o 用移液管移取2 5 m L溶液 A 1 至 1 0 0 mL的容量瓶(4.3.2)中。用乙醇定容并摇匀(溶液B D,用移液管移取 1 0 m l,溶液 B 1 至 1 0 0 m l的容量瓶中加人 6 0 mL乙醇和 2 m L氢氧化钠溶液(4.2.2),混合均匀。用乙醇定容并摇匀(溶液C D.4.4.1.2 参比溶液的制备 将2 m L 氢氧化钠溶液(4.2.2)用移液管
12、加人一个1 0 0 m L的容量瓶中，并用乙醇定容并摇匀，制成参比溶液。4.4.1.3 测定 用分光光度计(4.3.6)和样品池(4.3.7)测定并记录在 2 5 0 n m 4 2 0 n m波长范围的溶液 C 1 相对于参比溶液(4.4.1.2)的光谱图。4.4.1.4 计算 最大的吸收发生于3 5 0 n m士3 n m，其吸光度应在。.2 0.8 之间。从大约 2 7 0 n m-3 8 0 n m处画一条基线。记录最大吸光度(A m.)及相同波长的基线吸光度(A-.)，按式(3)计算香兰素的比 吸光度(州粼):_ 1。_1 0 0(A-，一 A-)。1 菇 一m.(3)式中:m 用于
13、制备溶液的香兰素的质量，单位为毫克(m g).4.4.2 试样的制备 将样品磨碎并混合均匀。4.4.3 称样 称取2 0 g 已制备好的 样品(4.4.2),精确至。0 0 1 g o4.4.4 抽提 在抽提仪器(4.3.5)中用大约2 0 0 m L乙醇(4.2.1)，抽提试样 1 6 h，即溶剂进行2 5 次3 0 次循环。将其转移至一个2 5 0 m l 一 的容量瓶(4.3.2)中 用少量的乙醇冲洗抽提仪器中的烧瓶数次，然后将这些洗出液倒人容量瓶(4.3.2)中。用乙醇定容并混合均匀(溶液 A 2).4.4.5 参比溶液的制备 用移液管将2 m L氢氧化钠溶液(4.2.2)加人一个 1
14、 0 0 m L的容量瓶(4.3.2)用乙醇稀释至刻度，混合均匀，制成参比溶液。4.4.6 测定 用移液管将 2 5 m L A 2 溶液加人一个 1 0 0 m L容量瓶中，用乙醇定容并混合均匀(溶液B 2)o 用移液管将 2 0 m I.B 2 溶液加人一个 1 0 0 m L容量瓶中，用乙醇定容并混合均匀(溶液C 2),用移液管将 1 0 m L C 2 溶液加人一个 1 0 0 m l，容量瓶。加人约6 0 mL乙醇和2 m L氢氧化钠溶液(4.2.2)。用乙醇定容并混合均匀(溶液 D 2)用分光光度计(4.3.6)和样品池(4.3.7)测定并记录在波长范围2 5 0 n m-4 2
15、0 n m D 2 溶液相对于 aN Y/T 7 1 3-2 0 0 3参比溶液(4.4.5)的光谱图。4.4.7 结果计算 香兰素含量W，用样品质量百分数表示，按式(4)计算:W，二5 0 000(A-、一A,)E i m Xm.(4)式中:A,。二 最大吸光度;A u 相同波长下基线处的吸光度;洲粼 香兰素的比 吸光度(4.4.1.4);m 用于抽提的试样的质量，单位为克(9)。如果要将结果表示为相对于干物质的含量，将产品的水分含量计算进去即可。5 气相色谱法5.1 原理 用无水乙醇抽提试样，加入一种内标物用气相色谱法分离，再用F I D检测器测定香兰素的含量。5.2 试荆 分析纯。5.2
16、.1 无水乙醇。5.2.2 无水硫酸钠。5.2.3 内标:丁香酚(9 8%)05.2.4 香兰素标准品:纯度大于9 9%05.2.5 标准溶液的配制:准确称取香兰素标准品，用无水乙醇溶解，配制成1.0 0 m g/m L的香兰素标准溶液，分别吸取1.0 0 m L,2.0 0 ml-,5.0 0 m L,1 0.0 0 m L标准溶液于1 0 m L比色管中，用无水乙醇定容到1 0.0 0 m L，加人2.0 0,L丁香酚和少量无水硫酸钠，充分摇匀后，上机测定。5.3 仪器5.3.1 气相色谱仪，附F I D检测器。5.3.2 索氏抽提仪(3.3.4)05.4 样品制备 将样品充分研磨并充分均匀。5.5 分析步骤5.5.1 提取 称取样品约2.5 g(5.4),精确至0.0 0 1 g。用无水乙醇抽提试样1 6 h，即溶剂进行2 5 次3 0 次循环。提取液合并，定容到1 0 0 m L，取5.0 0 m L提取液加人2.0 0 I L丁香酚内标，摇匀后上机。5.5.2 测定5.5.2.1 气相色谱参考条件5.5.2.1.1 色谱柱:玻璃柱，1.1 m X 3.2 m m，内 装填有O