1、ICS 65.020.20 B 05 DB36 江西省地方标准 DB 36/T 17702023 茶树菇液体菌种生产技术规程 Technical regulation of production of liquid spawn for cyclocybe cylindracea 2023-04-07 发布 2023-10-01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 17702023 1 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 生产厂房和设备.1 5 生产原料.2 6 母种扩繁.2 7 摇瓶液体菌种生产.2 8 发酵罐液体菌种生产.3
2、9 液体菌种贮存.4 10 记录和存档.4 DB36/T 17702023 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则 规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：江西农业大学、江西天和食用菌开发有限公司。本文件起草人：霍光华、朱宏杰、余福生、邱桂根、崔朝宇、霍达、陈绪涛。DB36/T 17702023 1 1 茶树菇液体菌种生产技术规程 1 范围 本文件规定了茶树菇(Cyclocybe cylindracea)液体菌种生产的术语和定义、生产
3、厂房和设备、生产原料、母种扩繁、摇瓶液体菌种生产、发酵罐液体菌种生产、液体菌种贮存、记录和存档等技术内容。本文件适用于茶树菇液体菌种的生产。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 150.2 压力容器 第 2 部分：材料 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 12728 食用菌术语 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 2375 食用菌生产技术规范 3 术语和定义 GB/T 12728中界定的术语和定义适用于本
4、文件。3.1 液体菌种 liquid spawn 用于生产和销售的菌丝体及其生长基质组成的液体繁殖材料，包括摇瓶液体菌种、发酵罐液体菌种。4 生产厂房和设备 4.1 场址选择 液体菌种生产厂房设计应符合 GB 50073 的规定。液体菌种生产场址应建在交通方便，水源和电源充足，无有害气体、烟雾、灰沙，远离垃圾场、畜禽场舍等有污染的地方，且道路路面硬化、排水良好。4.2 生产厂房布局和要求 生产厂房布局应满足以下要求：a)生产厂房车间应符合 NY/T 2375 要求；b)液体菌种生产车间应包括配料间、灭菌室、冷却室、接种室、培养室、发酵室、化验室、菌种室等，并配备相应设施设备；DB36/T 17
5、702023 2 c)地面要求防水、防滑、防腐蚀、防渗漏、易清洗；d)墙壁和天花板应能防水、防潮、防霉、易清洗；e)厂房安装排水管道或者排风设备，配置封闭式废物桶，有适当的排水坡度（1.0%1.5%）和良好的排水系统，排水沟应是圆弧似的明沟；f)厂房车间入口处应设置洗手消毒和干手设施。4.3 生产设备 生产设备包括不限于以下内容：a)液体菌种发酵罐、显微镜、磁力搅拌机、空气压缩机、高效空气过滤器、液体菌种接种器、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅炉、净化工作台、恒温摇床、恒温培养箱、除湿机、玻璃三角瓶、玻璃平皿；b)液体菌种发酵罐、高压蒸汽灭菌锅和蒸汽锅炉应符合 GB 150.2 的规定；c)高效空气过滤
6、器：对粒径 0.1m0.2m 粒子的补集效率在 99.99%以上；d)玻璃三角瓶容积 500ml、1000 ml，两者均耐 121高温灭菌。5 生产原料 培养基质、化学投入品应符合 NY/T 2375 要求，生产用水应符合 GB 5749 要求且水不溶物物料需过 140 目筛。6 母种扩繁 母种选用茶树菇试管种扩繁，即选取保存在试管斜面的茶树菇菌块转接至PDA平板中央，261条件下培养，接近长满平板时，从培养箱中取出作为摇瓶生产的菌种。7 摇瓶液体菌种生产 7.1 培养基配方 马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.2%、蛋白胨0.1%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.1%、余量为水，pH
7、自然。7.2 培养基制作 培养基制作流程如下：1)分装：将配制好的 200ml 培养基加入 500ml 的玻璃三角瓶中，或 400ml 培养基加入 1000ml 的玻璃三角瓶中。2)灭菌：装有培养基的三角瓶立即用封口膜（耐高温组培封口膜）封口，后置于灭菌锅中灭菌，灭菌条件：0.1Mpa、121灭菌 25min。3)冷却：灭菌后的培养基置于干净冷却室内冷却至室温（28）。7.3 接种 在超净工作台上使用直径7 mm的打孔器在平皿菌丝生长旺盛处打孔，后用无菌接种铲接种于三角瓶培养基中，立即封口避免杂菌污染。DB36/T 17702023 3 7.4 培养 7.4.1 培养：将接种后的三角瓶置于摇床
8、上振荡培养，转速为 160 rpm，261下培养 7d。7.4.2 培养期检查：摇瓶培养期间应定期检查，及时剔除污染杂菌的三角瓶。8 发酵罐液体菌种生产 8.1 前期准备 8.1.1 空气过滤器检查和灭菌 8.1.1.1 检查：使用前应检查空气过滤器滤芯，要求无油污、料污、无破损，外壳内外壁要求无污物、光洁亮净。8.1.1.2 灭菌：检查完后空气过滤器应高压蒸汽灭菌，灭菌条件：0.20Mpa0.30Mpa、温度达 125时，高压蒸汽灭菌 3h。8.1.2 发酵罐检查和灭菌 8.1.2.1 检查：检查罐上的所有阀门，安全阀、压力表、要求完好，工作正常。8.1.2.2 清洗：对罐体内、外和所有阀门
9、用流水进行冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物的洁净程度。8.1.2.3 空消：发酵罐初次使用、出现染菌、长期放置、更换品种时，都要求使用外源蒸汽进行灭菌；灭菌条件：发酵罐罐体内压力 0.120Mpa0.140Mpa、温度达 125时高压蒸汽灭菌 3h。8.2 培养基制作 8.2.1 配方 培养基配方如下：a)配方 I：玉米粉 3%、豆柏粉 0.3%、KH2PO4 0.05%、MgSO4 0.15%、余量为水，pH 自然；b)配方 II：豆柏粉 0.8%、白砂糖 2.5%、胡萝卜粉 2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、消泡剂 0.002%、余量为水，pH 自然。8.2.2 投
10、料 将配置好的液体培养基原料充分溶解，加适量温水搅拌均匀，倒入或用泵抽入发酵罐中，加水定容至所需体积（液体培养基占罐体体积的60%70%），密封上料口。8.2.3 实消 采用外源蒸汽对投料后的发酵罐进行实消。发酵罐罐体内压力0.20 Mpa0.30 Mpa、温度125时，容积700 L发酵罐灭菌3 h（其他型号罐体灭菌时间视灭菌效果作相应调整）。8.2.4 冷却 实消灭菌结束后将冷水通入发酵罐夹层或者内置冷却系统中循环，使液体培养基降温至 2426。降温过程中及时向发酵罐通入无菌空气防止罐压回零。8.3 接种 采用火焰保护接种方法，把火焰圈放在投料口的上方点燃，打开进料口盖，将摇瓶液体菌种迅速
11、投DB36/T 17702023 4 入罐培养基中（接种量的体积比为 2%3%），迅速盖好进料口盖密封并移去火焰圈。8.4 培养 培养时控制进气阀的无菌空气通风量至 0.5m3/h、罐压保持在 0.03Mpa0.05Mpa、培养温度 261。培养 5d 后，发酵罐液体菌种达到后续表 1 和表 2 要求，供液体菌种接种器接种使用。表1 感官指标 项目 指标 项目 指标 菌液色泽 球状菌丝体呈淡黄色，菌液呈半透明状。菌液形态 菌液稍粘稠，有大量微小菌丝球（直径1mm)悬浮、分布均匀。菌液气味 有淡淡的菇香味，无异味。表2 理化和生物指标 项目 指标 项目 指标 pH 值 6.36.8 量筒承装液体
12、观察 菌丝层在下 显微镜下菌丝形态和杂菌鉴别 菌丝粗壮，无杂菌 留存样品无菌检查 平板有茶树菇菌丝生长，无其他杂菌生长。接菌实验 液体菌种接入菌袋中，仅有茶树菇菌丝生长，无其他杂菌生长 8.5 取样及检测 8.5.1 取样 取样包括发酵罐灭菌后的空白培养基样品和培养过程中定期从发酵罐中取出的样品，用作镜检和无菌检测。上述样品应置于 4冰箱内保存一周以上，以备检测或复检。8.5.2 检测 检测项目包括不限于以下内容：1)发酵罐灭菌后的空白培养基样品涂布于无菌琼脂平板上 281恒温培养 2 d5 d，及时观察是否有细菌、霉菌、酵母菌等杂菌生长；2)对培养过程中定期所取样品开展感官、pH、显微等检测，确定菌丝生长发育状态并排除杂菌污染。9 液体菌种贮存 液体菌种生产完成后应及时使用，如不能及时使用进行贮藏，贮藏条件：在发酵罐内注入无菌空气，保持罐压 0.04Mpa0.05Mpa 时，料温 610可保存 3d，1115可保存 2d。10 记录和存档 液体菌种生产的每个环节应有详实的生产记录，并由具体操作人员现场记录填写，档案保存 2 年以上。_