1、ICS 13.060.01CCS Z 10DB50重庆市地方标准DB 50/T 13652023水质 大环内酯类和林可酰胺类抗生素的测定 液相色谱串联质谱法2023-03-01 发布2023-05-01 实施重庆市市场监督管理局发 布DB50/T 13652023I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14方法原理.15干扰与消除.16试剂和材料.17仪器和设备.28样品.29分析步骤.310结果计算与表示.611精密度和正确度.712质量保证和质量控制.713废弃物的处理.8附录 A（规范性）方法的检出限和测定下限.9附录 B（资料性）方法的精密度和正确度.10DB50/
2、T 13652023II前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由重庆市生态环境监测中心提出。本文件由重庆市生态环境局归口并组织实施。本文件起草单位：重庆市生态环境监测中心。本文件主要起草人：郑璇、田隽、李新宇、张文斌、沈冬君、李莉、邹家素、蹇川、张晓岭、张君、郭志顺、孙静、刘海立、邹素兰。DB50/T 136520231水质 大环内酯类和林可酰胺类抗生素的测定 液相色谱串联质谱法1范围本文件规定了液相色谱-串联质谱法对水中7种大环内酯类和2种林可酰胺
3、类抗生素进行测定的方法。本文件适用于地表水、地下水和废水中林可霉素、螺旋霉素、克林霉素、竹桃三乙酸、琥乙红霉素、麦迪菌素、交沙霉素、克拉霉素、罗红霉素等9种抗生素的测定。若通过验证，本文件也可适用于其他大环内酯类或林可酰胺类抗生素的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注目期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。HJ 91.1 污水监测技术规范HJ 91.2 地表水环境质量监测技术规范HJ 164地下水环境监测技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法原理
4、水中的目标化合物经固相萃取柱富集，用液相色谱-串联质谱分离检测。根据保留时间和特征离子峰定性，内标法定量。5干扰与消除金属离子与目标化合物能形成络合物，使固相萃取效率降低，可向水样中加入乙二胺四乙酸二钠抑制络合物的形成。6试剂和材料警告本标准所使用的有机溶剂对人体健康有害，试剂配制和样品前处理过程应在通风橱内进行，操作时应按规定要求佩带防护器具，避免接触皮肤和衣服。DB50/T 1365202326.1除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的超纯水。6.2氢氧化钠（NaOH）：分析纯。6.3盐酸（HCl）：1 mol/L，分析纯。6.4甲醇（CH3OH）：农残级或
5、等同规格。6.5甲酸（HCOOH）：色谱纯。6.6甲酸溶液（0.05%）：取 50 l 甲酸（6.5）溶于 100 ml 实验用水中。6.7甲酸/甲醇溶液：取 90 ml 甲酸溶液（6.5）和 10 ml 甲醇（6.4）混合，摇匀。6.8乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）：分析纯。6.9标准贮备液：=1.00 g/L可直接购买有证标准溶液，也可用标准物质配制，标准物质纯度大于99.0%。用甲醇（6.4）溶解，贮备液在-10以下冷冻、避光保存不超过6个月或参照制造商的产品说明。6.10混合标准中间液：=100 g/ml移取适量标准贮备液（6.9）按需要用甲醇（6.4）稀释，中间液应于-10以下冷
6、冻、避光保存不超过3个月。6.11混合标准使用液：=1.00 g/ml（参考浓度）将混合标准中间液（6.10）按需要用甲醇（6.4）稀释，-10以下冷冻，避光保存不超过7天。6.12内标贮备液：=1.00 g/L内标为红霉素13CD3(Erythromycin13CD3),可直接购买有证标准溶液，也可用标准物质溶于甲醇（6.4）。贮备液在-10以下冷冻、避光保存不超过6个月或参照制造商的产品说明。6.13内标中间液：=100 g/ml将内标贮备液（6.12）按需要用甲醇（6.4）稀释，-10以下冷冻、避光保存不超过 3 个月。6.14内标使用液：=10.0 g/ml（参考浓度）将内标中间液（6
7、.13）按需要用甲醇（6.4）稀释，-10以下冷冻，避光保存不超过7天。6.15固相萃取柱填料为二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（HLB）或同等柱效的萃取柱，规格为6 ml/150 mg。6.16滤膜：0.22 和 0.45 m 玻璃纤维聚膜或其他材质等效滤膜。6.17氮气：纯度99.99%。6.18氩气：纯度99.99%。7仪器和设备7.1液相色谱/串联质谱仪：配有电喷雾离子化源(ESI)。7.2色谱柱：C18 柱或等效反相高效液相色谱柱，参考规格为 100 mm2.1 mm 1.9 m。7.3浓缩装置：K-D 浓缩器或氮吹浓缩仪等性能相当的设备。7.4固相萃取装置：自动或手动，流速可调节
8、。7.5一般实验室常用仪器。8样品8.1采集与保存参照HJ 91.1、HJ 91.2和HJ 164的相关规定采集样品于4 000 ml磨口棕色玻璃瓶中，水样应充满采样瓶，不留液上空间。样品采集后应尽快进行分析。如暂不能分析，应在0 4 避光保存，14天内完成萃取。DB50/T 1365202338.2样品制备将固相萃取柱（6.15）固定在固相萃取装置(7.4)上，分别用10 ml甲醇（6.4）和10 ml实验用水活化固相萃取柱（6.15），保证小柱柱头浸润。水样经0.45 m 滤膜（6.16）过滤，取1 000 ml水样，加入1 g Na2EDTA（6.8），用氢氧化钠（6.2）和盐酸（6.3
9、）调节pH值为至6.0，水样以低于10 ml/min（约3滴/秒4滴/秒）的流速通过小柱，用10 ml实验用水洗涤小柱，用氮气（6.17）吹干小柱，再用10 ml甲醇（6.4）洗脱，收集洗脱液于洁净试管中，洗脱液经浓缩装置（7.3）浓缩至干，加入内标使用液（6.14）5.00 l，用甲酸/甲醇溶液（6.7）定容至1 ml，经0.22 m 滤膜（6.16）过滤，置于样品瓶中，待测。当样品体积为1 000 ml，浓缩后定容体积为1.0 ml，进样体积为10 l，检出限为2 ng/L，测定下限为8 ng/L，详见附录A。8.3空白样品的制备以实验用水代替样品，应按照样品制备（8.2）相同操作步骤，制
10、备空白样品。9分析步骤9.1仪器参考条件9.1.1液相色谱分析条件流动相A：甲酸溶液(6.5)，流动相B：甲醇（6.4），梯度洗脱程序见表1，流速：200.0 l/min；柱温：35；进样量：10l；具体参数见表1。9.1.2质谱分析条件正离子模式:ESI喷雾电压(Spray voltage):3 000 V毛细管温度:350 鞘气(N2)流速:45 L/min辅助气(N2)流速:15 L/min碰撞气(Ar)压力:200 mPa选择反应监测(SRM)，具体参数见表2。表 1液相色谱流动相梯度洗脱程序时间min流动相A%流动相B%0.0090103.5090104.0010908.901090
11、9.00901010.509010DB50/T 136520234表 2目标化合物的选择反应监测条件序号目标物母离子m/z子离子m/z碰撞能量eV锥孔电压V1林可霉素407.2359.2a1884126.227842螺旋霉素438.3174.1a2173145.115733克林霉素425.2377.2a1880126.128804竹桃三乙酸772.4156.0a2782586.318825琥乙红霉素734.5576.2a1792158.029926红霉素-13CD3738.4162.1a3191580.319917麦迪菌素814.1108.9a32100173.8311008交沙霉素828.5
12、109.0a33114174.0311149克拉霉素748.2158.0a2696590.1169610罗红霉素837.3679.3a2097158.03097注：a为定量子离子9.1.3仪器调谐按照仪器使用说明书在规定时间和频次内对液相色谱-串联质谱仪进行仪器质量数和灵敏度校正，以确保仪器处于最佳测试状态。在仪器使用过程中，如发现仪器质量数出现明显偏差或灵敏度大幅度下降时，应立即对仪器重新进行质量数和灵敏度校正。9.2校准9.2.1标准曲线的绘制取一定量混合标准使用液（6.11）于甲酸/甲醇混合溶液（6.7）中，制备至少5个浓度点的标准系列，9种抗生素的质量浓度均分别为2.00 g/L、5.
13、00 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L、50.0 g/L、100 g/L（此为参考浓度），于每毫升标准系列中加入5.00 l内标使用液（6.14），使内标的质量浓度为50.0 g/L，贮存在棕色进样小瓶中，待测。由低浓度到高浓度依次对标准系列溶液进样，以标准系列溶液中目标组分的浓度为横坐标，以其对应的峰面积（或峰高）与内标物峰面积(或峰高)的比值和内标物浓度的乘积为纵坐标，建立标准曲线。如式（1）:baxy.(1)式中：DB50/T 136520235x目标组分浓度的数值，单位为微克每升（g/L）；y目标组分和内标物的峰面积（或峰高）比值与内标物浓度乘积的数值；a标准曲线斜率的数值；
14、b标准曲线截距的数值。9.2.2标准参考谱图在本标准推荐的仪器参考条件下，目标化合物的提取离子流色谱图见图1。RT:0.00-10.000.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.0Time(min)020406080100020406080100020406080100Relative Abundance0204060801000204060801005.104.905.42 5.703.433.072.912.384.584.423.594.037.366.206.52 6.737.746.059.888.9
15、38.398.249.609.318.567.165.735.125.263.713.595.932.43 2.68 2.924.022.224.707.644.426.938.793.247.188.216.598.97 9.296.169.808.547.855.375.522.115.802.685.186.059.597.658.642.298.323.46 3.636.686.417.479.889.177.268.982.983.998.114.844.385.915.376.225.698.202.844.156.513.283.702.462.208.426.838.997.7
16、57.189.884.849.484.477.588.755.075.936.177.635.619.842.072.982.746.763.91 4.117.794.849.037.063.237.294.559.405.473.588.742.395.008.438.076.47NL:2.82E6TIC F:+c ESI SRM ms2 407.201 126.170-126.172,359.182-359.184 MS 100PPB-005FA-methanolNL:1.20E6TIC F:+c ESI SRM ms2 425.170 126.125-126.127,377.228-377.230 MS 100PPB-005FA-methanolNL:4.00E5TIC F:+c ESI SRM ms2 438.299 145.091-145.093,174.085-174.087 MS 100PPB-005FA-methanolNL:1.59E6TIC F:+c ESI SRM ms2 734.490 157.985-157.987,576.225-576.227 MS 100