1、NY/T1962-2010马铃薯纺锤块茎类病毒检测1范围本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTV)的检测方法。本标准适用于马铃薯种薯、商品薯、试管苗及其根、茎、叶不同部位组织中的马铃薯纺锤块茎类病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法方法一聚合酶链式反应3原理类病毒是没有外壳蛋白、裸露的、低分子闭合环状RNA分子，RNA分子大小在246t401nt之间，马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的序列在356nt3
2、60nt之间。根据PSTVd序列设计特异性引物，进行扩增，扩增片段大小为359bp左右。4试剂与材料以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。4.1三氯甲烷。4.2M-MLV反转录酶(200u/L)。4.3RNA酶抑制剂(40u/L)。4.4 Tag DNA聚合酶(5u/L).4.5焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水。在100mL水中，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)50L,室温过夜，121高压灭菌20min,分装到1.5mL DEPC处理过的微量管中。4.63mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)。称取乙酸钠3HO24.6g,加水80mL溶解，用冰乙酸调pH至5.2，定容至100mL。4.7水饱和酚(pH4.0)。4.8溴化乙锭溶液(10mg/mL)。称取溴化乙锭200mg,加水溶解，定容至20mL。4.91mol/L三羟基甲基氨基甲烷一盐酸(Tris-HCI)溶液(pH8.0)。称取Tis碱121.1g,溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL,121高压灭菌20min。4.10RNA提取缓冲液。称取Tis碱12.12g,氯化钠5.88g,乙二胺四乙酸二钠3.75g,加水至900mL,溶解，用浓盐酸调1
