1、第四章第四章 细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术 解放军总医院基础医学研究所解放军总医院基础医学研究所 免疫学研究室免疫学研究室 黄建华黄建华 细胞培养技术平台细胞培养技术平台 基因治疗基因治疗 基因诊断基因诊断 试管婴儿试管婴儿 组织工程组织工程 药物筛选药物筛选 致病机理致病机理 主要内容主要内容 基本操作技术和要求基本操作技术和要求 原代培养原代培养 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持 细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏 细胞培养污染的检测和排除细胞培养污染的检测和排除 细胞是生命活动的基本单位细胞是生命活动的基本单位 16651665年英国学者年英国学者Robert HookeR
2、obert Hooke，用自制的显微镜观察软，用自制的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文拉丁文CellaCella（小室）词（小室）词.19831983-3939德国植物学家施莱登和动物学家施旺德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了确立了“细胞学说细胞学说”的基本原则。的基本原则。（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己 的的“生命生命”。（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。（）新的
3、细胞可以通过老的细胞繁殖产生。进化论，遗传学和进化论，遗传学和细胞学说细胞学说定为现代生物学的三大基定为现代生物学的三大基 石，而细胞学说又是后二者的石，而细胞学说又是后二者的 基石基石。组织（细胞）培养组织（细胞）培养 从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法长并维持其结构和功能的方法 。细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医
4、生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。1 1 基本操作技术和要求基本操作技术和要求 由于体外培养的细胞没有抗感染能力，由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。因此防污染是决定培养成功的首要条件。一切操作需要一切操作需要保证无菌保证无菌和有条不紊。和有条不紊。1.1 1.1 培养室内的无菌技术培养室内的无菌技术 培养前的准备：按实验计划和程序培养前的准备：按实验计划和程序 准备准备 物品，作到心中有数物品，作到心中有数 培养室和超净台：定期全面彻底消毒培养室和超净台：
5、定期全面彻底消毒 培养用品的无菌处理：高压灭菌、过滤、培养用品的无菌处理：高压灭菌、过滤、酒精消毒酒精消毒 实验中无菌培养操作：均在火焰近处进实验中无菌培养操作：均在火焰近处进行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞，以防烧死细胞培养细胞，以防烧死细胞。1.2 培养细胞的培养细胞的 取材取材 基本要求：基本要求：取材组织用培养液浸泡，取材组织用培养液浸泡，4 4度运送，度运送，2424h h内尽快培养。内尽快培养。取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污
6、染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同时保留组织学和电镜标本，原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。对供体来源、部位及一般情况做记录。1.2.3 1.2.3 皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜的取材 皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源。皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源。取材方法似断层皮片手术，面积取材方法似断层皮片手术，面积2 2-3 3mmmm2.2.尽可能去除皮下和粘膜下组织。尽可能去除皮下和粘膜下组织。因分布在体表，故细菌、霉菌很多，需因分布在体表，故细菌、霉菌很多，需严格消毒，可用较高浓度抗菌素漂洗。严格消毒，可用较高浓度
7、抗菌素漂洗。1.2.4 1.2.4 内脏和实体瘤的取材内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌的，明确取材部位，去除结缔组织。的，明确取材部位，去除结缔组织。肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织，肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织，标本应按污染组织处理。标本应按污染组织处理。1.2.5 1.2.5 血细胞的取材血细胞的取材 血细胞培养可用于造血干细胞移植、免血细胞培养可用于造血干细胞移植、免疫活性细胞的治疗和染色体分析等。疫活性细胞的治疗和染色体分析等。取血抗凝剂量过大易导致溶血，肝素常取血抗凝剂量过大易导致溶血，肝素常用浓度为用浓度为2020U/
8、ml,U/ml,针管针管用较高浓度肝素用较高浓度肝素500500U/mlU/ml湿润。湿润。1.3 1.3 组织材料的分离组织材料的分离 欲从组织中获得大量生长良好的细胞，欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。须将组织分散开，使细胞解离出来。常用方法有常用方法有机械法机械法和和化学法化学法。1.3.1 1.3.1 细胞悬液的分离方法细胞悬液的分离方法 离心法：血液和体液等细胞悬液离心法：血液和体液等细胞悬液500500-10001000rpm rpm 转速转速 5 5-1010分钟。离心速度过大、分钟。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。时间过长，会造成细
9、胞损伤和死亡。密度梯度离心法：用离心法将细胞分到密度梯度离心法：用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的的细胞。层细胞。适于分离密度不等的的细胞。常用介质有常用介质有Ficoll 400,Percoll,Ficoll 400,Percoll,泛影葡胺泛影葡胺等。等。1.3.2.1 1.3.2.1 机械分散法机械分散法 适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。剪切组织为剪切组织为1 1mmmm3 3碎碎块块 后，置于组织匀浆研磨，
10、后，置于组织匀浆研磨，或用吸管反复吹打分散组织细胞或用吸管反复吹打分散组织细胞 组织液放在注射器内通过针头压出。组织液放在注射器内通过针头压出。注射器针芯挤压后，用注射器针芯挤压后，用PBSPBS液洗涤，分别液洗涤，分别通过通过不锈钢筛网不锈钢筛网80,150,40080,150,400目孔径筛网。目孔径筛网。记数活细胞数，制成细胞悬液接种。记数活细胞数，制成细胞悬液接种。1.3.2.3 1.3.2.3 消化分离法消化分离法 消化法是结合生化和化学手段把已剪切消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分化，获得成较小体积的组织进一步分化，获得细细胞悬液胞悬液直接进行培养直接进行培
11、养 1.3.2.3.1 1.3.2.3.1 胰蛋白酶法胰蛋白酶法 主要作用是对细胞间蛋白质水解，使细胞离散。主要作用是对细胞间蛋白质水解，使细胞离散。活性以消化酪蛋白的能力测定，常用活性以消化酪蛋白的能力测定，常用1 1：250250 消化效果与消化效果与pHpH值、温度、酶浓度和组织块大小值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关与硬度有关，对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切 钙镁离子和血清抑制活性钙镁离子和血清抑制活性 常用剂量为常用剂量为0.25%0.25%（0.10.1-0.5%0.5%），），pHpH值值 8 8（8 8-9 9）温度温度 3
12、737。4 4度配制应用液。度配制应用液。1.3.2.3.2 1.3.2.3.2 胶原酶法胶原酶法 只对细胞间质胶原组织起消化作用，使只对细胞间质胶原组织起消化作用，使上皮细胞与胶原成份分离上皮细胞与胶原成份分离 产品有产品有I I-V VII V VII-IX IX等型，分别适用于分离肝等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织 钙镁离子和血清不影响活性钙镁离子和血清不影响活性,pH.6.5pH.6.5-7 7 常用剂量为常用剂量为200200单位单位/mlml或或0.10.1 g/ml 0.3 g/ml 0.3 g/mlg/ml 1.3.2.3.
13、1.3.2.3.3 3 EDTAEDTA法法 EDTAEDTA（二乙烯四乙酸二钠）作用较缓和。二乙烯四乙酸二钠）作用较缓和。主要作用：能从组织生长环境中吸取维主要作用：能从组织生长环境中吸取维持组织完整的钙镁离子。持组织完整的钙镁离子。单独使用不能使细胞完全分散，单独使用不能使细胞完全分散，常用常用1:11:1的的EDTAEDTA（0.02%0.02%）和胰蛋白酶和胰蛋白酶0.25%0.25%混合液混合液 2 2 原代培养原代培养 也称初代培养也称初代培养,是从供体取得组织细胞后是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。在体外进行的首次培养。细胞保持原有的基本性质，仍具二倍体细胞保持原有的基
14、本性质，仍具二倍体遗传物性。最接近和反映体内生长特性。遗传物性。最接近和反映体内生长特性。适合作药物测试，细胞分化研究。适合作药物测试，细胞分化研究。原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，供体和细胞间有很大差异。供体和细胞间有很大差异。2.1 2.1 组织块培养法组织块培养法 将组织剪成小块后，接种于培养瓶，将组织剪成小块后，接种于培养瓶，2424小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮细胞的生长。细胞的生长。如需做组织染色或电镜检查，可将组织如需做组织染色或电镜检
15、查，可将组织可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死亡亡 2.2 2.2 消化培养法消化培养法 采用前述的组织消化分散法。将妨碍采用前述的组织消化分散法。将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。3 3 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持 培养细胞增殖长满瓶壁时，既达到所谓培养细胞增殖长满瓶壁时，既达到所谓的饱和密度的饱和密度。此时正常细胞则不再生长；此时正常细胞则不再生长；恶性
16、细胞重叠生长恶性细胞重叠生长，易于从瓶壁上成片易于从瓶壁上成片脱落脱落,，为此传代势在必行。，为此传代势在必行。培养细胞的生长过程培养细胞的生长过程 1 1）原代（初代）培养期原代（初代）培养期：从机体取下组织培养到第一次传代，从机体取下组织培养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持时间，因细胞种类不同，一般持时间，因细胞种类不同，一般1 1-4 4周。周。2 2）传代期培养传代期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。代，使其连续生长。一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代3030-5050代，此时可代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisiscrisis）有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞