1、I C s 1 1.2 2 0B 4 1NY中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 5 3 9-2 0 0 2副结核病诊断技术D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r p a r a t u b e r c u l o s i s2 0 0 2 一 0 8 一 2 7 发布2 0 0 2 门2 一 0 1实施中 华 人 民 共 和 国 农 业 部发 布N v/T 5 3 9-2 0 0 2前言 副结核病(p a r a t u b e r c u l o s i s,l o h n e s d i s e a s e)是由
2、副结核分枝杆菌(m y c o b a c t e r i a p a r a t u b e r c u l o s i s)引起的以反当动物为主的一种慢性、消耗性传染病，其临床症状以持续性腹泻和慢性消瘦为特征。该病广泛地分布于世界各国，引起较大的经济损失。世界动物卫生组织 Wo r l d O r g a n i z a t i o n f o r A n i m a lH e a l t h(英),O f f i c e I n t e n t i o n a l d e s E p i z o o t i c(法),O I E 将其划为B 类传染病，我国也将其划为II 类传染病。副结核
3、病潜伏期长，有的终生感染而不表现出临床症状。至目前为止，尚无治疗该病的有效方法，防治该病的主要方法是监测、隔离和淘汰病畜。目 前该病的检疫方法有细菌学检查和免疫学检查。后者主要是包括皮内变态反应、琼脂扩散试验、间接红细胞凝集试验、淋巴细胞转化试验、补体结合反应和酶联免疫吸附试验(E L I S A)。本标准提出的补体结合反应、皮内变态反应和E L I S A方法与O I E推荐的可选择方法基本一致。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:吉林农业大学、吉林省兽医研究所。本标准起草人:何昭阳、吴玉环、
4、顾万钧、钱爱东。N Y/T 5 3 9-2 0 0 2副结核病诊断技术1 范围 本标准规定了副结核病的诊断技术。本标准的细菌学检查、皮内变态反应、补体结合反应适用于牛、羊、鹿等动物的副结核病诊断;E L I S A检疫方法适用于牛的副结核病诊断。2 细菌学检查2.，材料准备 。.5%氢氧化钠液、水浴糟、离心机等。抗酸染色法试剂:配制及染色方法见附录A,2.2 操作方法 取待检粪样(尽可能取带有粘液或血丝的粪便)1 5 g-2 0 g，加约3 倍量的0.5 0 0 氢氧化钠液，混匀，5 5 C 水浴乳化 3 0 m i n,以4 层沙布过滤，取滤液 1 0 0 0 r/m i n离心 5 mi
5、n，去沉渣后，再以3 0 0 0 r/m i n4 0 0 0 r/m i n 离心3 0 m i n，去上清，用沉淀涂片。也可以直肠刮取物、病变肠段粘膜直接涂片。火焰固 定，抗酸染色(见附录A)后镜检。2.3 结果判定 发现在细胞内有被染成红色、成丛排列的短杆菌即为细菌检查阳性(+)，否则判为细菌检查阴性(一)。3 皮内变态反应试验3.1 材料准备3.1.1 器材 游标卡尺、灭菌的1 m L注射器及针头、了 5%酒精棉、记录本等。3.1.2 变应原 副结核分枝杆菌提纯蛋白衍生物(副结核P P D)或禽分枝杆菌提纯蛋白 衍生物(禽结核P P D),3.2 操作方法3.2.1 将被检动物编号，在
6、颈侧中三分之一处中部的健康皮肤处剪毛，直径约 1 0 c m，将注射部位的皮肤用手捏起，以卡尺测量皮肤皱褶厚度并记录。局部消毒。3.2.2 将变应原以灭菌生理盐水稀释至。5 m g/m L，与皮肤呈1 5 0 -2 0 0 的角度进行皮内 注射。注射后注射部位应呈现绿豆至黄豆大小的小包。无论动物种类及大小一律皮内注射0.1 m L。如注至皮下或溢出，应于离原注射点 8 c m以远处补注一针，并在记录中加以说明。3.2.3 羊在尾根无毛的皱褶部进行皮内注射。3.3 结果判定 注射7 2 h 观察反应，检查注射部位有无热、肿、痛等炎性反应，并以卡尺测量注射部位的皮肤皱褶厚度。3.3.1 判定标准如
7、下:a)变态反应阳性(十):局部有炎性反应，皮厚差)4 mm.N Y/T 5 3 9-2 0 0 2 b)变态反应疑似士 局部炎性反应不明显，皮厚差 2.1 mm-3.9 m m c)变态反应阴性(一)局部无反应或炎性反应不明显，皮厚差2.0 m m,3.3.2 羊有反应者(不论皮厚差大小和炎性反应轻重)判为变态反应阳性(+)，无任何反应者判为变态反应阴性(一)3.3.3 变态反应疑似，应于3 个月后复检，于注射部位对侧的相应部位进行皮内注射，7 2 h 后仍判为变态反应疑似，则判为变态反应阳性。4 补体结合反应试验4.1 材料准备4.1.1 器材 1 2 m m X 3 7 m m小试管、试
8、管架、刻度吸管等。4.1.2 试剂 3%绵羊红细胞悬液:采集绵羊红细胞放于阿氏液中，4 C 保存。使用时，以生理盐水洗涤3 次，最后一次要求2 5 0 0 r/m i n 离心1 5 m i n，弃上清得红细胞泥，以生理盐水配制成体积分数为3 写的绵羊红细胞悬液。溶血素、补体、禽分枝杆菌提取的脂多糖抗原、标准阳性血清、标准阴性血清等。4.2 操作方法4.2.1 预备试验4.2.1.1 溶血素效价测定 取溶血素。.2 m L(商品溶血素加有等量的甘油)，加人9.8 m L生理盐水，即为1，1 0 0 稀释，再按表 1 进行稀释和表 2 进行溶血素效价测定。表，溶血素稀释表单位为毫升试管号1234
9、56789稀释倍数1:1 0 0 01:2 0 0 01:3 0 0 01-4 0 0 01:5 0 0 01，6 0 0 01:7 00 01.8 00 01.9 00 0生理盐水9123456781 1 0 0 溶血素11:1 0 0 0 溶血素11111111表2 溶率紊效价测定表单位为毫升试管号1234567891 01 11 2试脸组对照组 稀释倍数已 稀释的 榕血家 1:4 0 补体 生理盐水 3%红细胞1:1 0 0 0 0.1 0.2 0.2 0.11:2 0 0 0 0.1 0.2 0.2 0.11 3 0 0 0 0.1 0.2 0.2 0.11:4 0 0 0 0.1 0
10、.2 0.2 0.11 5 0 0 0 0.1 0.2 0.2 0.11+60 0 0 0.1 0.2 0.2 0.11:7 0 0 0 0.1 0.2 0.2 0.11:8 0 0 0 0.1 0.2 0.2 0.11:9 0 0 0 0.1 0.2 0.2 0.11:1 0 0 0 0.1 0.4 0.10.20.30.1:.:摇匀，3 7 水浴 1 0 m i n结果判定(例)+十 十禅#以能完全溶血的溶血素最高稀释倍数为1 个溶血素单位(即效价)。表2 第5 管为1 个溶血素单位。正式试验时采用4 个溶血素单位，即5 0 0 0/4=1 2 5 0 倍，故正式试验时，将商品溶血素稀释6
11、 2 5 倍即可4.2-，.2 补体效价测定 将补体以生理盐水进行 1:4 0 稀释。3%红细胞悬液与等量的4 个单位溶血素混合，即成致敏红细胞。按表 3 进行补体效价测定。N Y/T5 3 9 一2 0 0 2表 3 朴体效价测定单位 为毫升试管号l234567对照1:4 0 补体生理盐水2 单位抗原致敏红细胞0.050.2 50.10 20 0 80.2 20 10.20.1 10 1 9O l0.20 1 40 1 60 l0.20 1 70 1 30.10.20.2 00.1 00.10.20.230.070 10.20 30.10.2一一一升一.行.摇匀，3 7 水浴 Z Omi n
12、结果判定(例)+十#以能完全溶血的补体最小量为1 个补体单位(即效价)，正式试验采用2 个单位。表3(例)的补体单位为。.08，按公式计算出正式试验的补体稀释倍数。即补体的稀释倍数=。Z K4 0/补体用量一0.Z x4 o/0.0 8=1 0 0，使用时用2 个单位补体，即正式使用时，取补体 0.Z m L，加9.s m L生理盐水即可。4，2.1.3 抗原效价测定 将抗原Z m 创冻干品功口 人l m l，生理盐水使其溶解并做系列稀释，然后按表4 进行抗原效价测定。以与阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释倍数为 1 个抗原单位(效价)，在表 4(例)中1:10。为 1 个抗原单位
13、。正式试验时，使用2 个单位抗原，即将抗原做 1:50稀释即可。表 4 抗原效价测定单位为毫升试管号123456抗原稀释倍数抗原用量 改:5 改:。;1l00，;l00;理对照阳性血清A列 1:弓B列 1:1 0C列 1:2 0D列 1，4 00.10 l0.10。10.10 t l0 l0.10.10.10.10.10.10 10.10 l0.10.1O l0 10 10.10.10.1阳性血清E列 1:5生理盐水2 单位补体0.10.20.10 20 10.20，10.20 l0.20.10.10 2摇匀，4 感作过夜致敏红细胞0.20 20，20 20.20.2摇匀，37水浴 20m m
14、，取出置室温 3 h 后判定结果判定(例)阳性血清A列 1:5B列 1:1 0C列 1:2 0D列 1:4 0#廿徉#.#廿#十+#+阴性血清E列 1留 5 04.2.2 正式试验 被检血清，以生理盐水1，5 稀释，58水浴灭能30 m in。致敏红细胞、2 个单位补体、2 个单位抗原。3 只1N Y/T 5 3 9-2 0 0 2各要素加量如表 5 所示。表 5 正式试验表单位为毫升试管号12345678试验组对照组阳性阴性被检红细胞血清血清血清抗原补体被检血清1，5被检血清 1，1 0阳性血清1，1 0阴性血清 1 0 1 0 2 个单位抗原2 个单位补体 生理盐水0.10.10.20.1
15、0.10.20.10.10.20.10.10.20.10.20.10.10.20.1:;0.4摇匀，4 C 组9 作过夜致敏红细胞。.20.20.20.23 7 C 感作2 0 m in，取出置室温3 h 后判定4.3 结果判定 在对照组成立的前提下(即阳性血清对照管 1 0 0%抑制溶血、红细胞对照不溶血，其他对照组均为1 o o%溶血)，判定试验管。被检血清1:5 为+,1:1 0 为+以上，判为补体结合反应阳性，被检血清1:5 为+或+，判为补体结合反应可疑;其他情况判为补体结合反应阴 性。补体结合反应结果，对照标准溶血管 配制方法见附录B(资料性附录)进行判定:#完全抑制溶血。上清无色
16、透明，红细胞全沉于管底。+7 5%抑制溶血。上清稍带红色，红细胞全沉于管底。+5 0%抑制溶血。上清呈浅红色，红细胞半数沉于管底。十2 5%抑制溶血。上清深红透明，红细胞少量沉于管底。一完全溶血。上清深红透明，管底无红细胞。5 酶联免疫吸附(E L I S A)试验5.1 材料准备5.1.1 器材 E L I S A板、酶联免疫检测仪、加样器、洗瓶、恒温箱等。5.1.2 试剂 副结核分枝杆菌亲和层析抗原、草分枝杆菌吸收抗原、兔抗牛I g G酶标抗体、牛副结核参考阳性血清和参考阴性血清。5.1.3 溶液配制方法5.1.3.1 抗原稀释液(p H 9.6):碳酸钠(N a 3 C O,)0.3 1 8 g,碳酸氢钠(N a H C 0 3)0 5 6 0 g，加去离子水少量使其溶解，待完全溶化后补充去离子水至1 0 0 0 M I,混匀。5.1.3.2 洗液(p H 7.4):磷酸氢二钠(N a 3 H P O,1 2 H 2 0)2.9 0 g,磷酸二氢钾(K H,P O,)0.2 0 g,抓化钠(N a C l)8.0 g,抓化钾(K C ll 0.2 0 g，吐 温-2 0(T w