1、I C SB 5 06 7.0 5 0Sc中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准S C/T 3 0 2 4-2 0 0 4腹泻性贝类毒素的测定生物法D e t e r m i n a t i o n o f d i a r r h o e a s h e l l f i s h p o i s o n B i o a s s a y2 0 0 4 一 0 1 一 0 7 发布2 0 0 4 一 0 3 一 0 1 实施中华 人 民共 和 国农业 部发 布S C A T 3 0 2 4-2 0 0 4o u青本标准参考了日 本厚生省推荐使用的腹泻性贝类毒素的测定方法。本标准的附录A为
2、资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准起草单位：国家水产品质量监督检验中心、中国水产科学研究院东海水产研究所。本标准主要起草人：王联珠、袁骥、李晓川、冷凯良、陈亚瞿、蒋玫。S C A T 3 0 2 4-2 0 0 4腹泻性贝类毒素的测定生物法1 范围 本标准规定了 腹泻性贝类毒素（D S P）的测定方法生物法。本标准适用于软体动物贝类可食部分中腹泻性贝类毒素（D S P)的测定。2 原理 用丙酮提取贝类中毒素，再转移至乙醚中，经减压浓缩蒸干后，再以1 吐温-6 0 生理盐水溶解残留物，注射小鼠，观察存活情况，计算其毒力。3 试剂和材料丙酮（分析纯）。乙醚（分析纯）。1 吐温一
3、6 0 生理盐水：称取1.0 g 吐温-6 0，溶于生理盐水（0.8%N a C l）中，并定容至1 0 0.0ICJq口QQ口Q口mL.4 仪器和设备4.1 旋转蒸发器。4.2 均质器。4.3 磨口烧瓶：圆底，5 0 0 m L,1 0 0 m L o4.4 布氏漏斗：0 1 0 0 二。4.5 分液漏斗：具塞，5 0 0 m L o4.6 天平：感量0.1 g o4.7 刻度试管：1 0 m L，具塞。4.8 冰箱：0 一 5 和一1 5 一一 2 0 C。4.9 注射器：1 m L o4.1 0 注射器针头：8#。4.1 1 小鼠：体重为1 6 g-2 0 g 的健康1 C l x 系雄
4、性小鼠。5 检样的制备5.1 生鲜带壳的贝类 a)用清水彻底洗净贝类外壳，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来杂质，仔细取出贝肉，切勿割破肉体；b)收集贝肉，沥水5 m in，捡出碎壳等杂物，迅速冷冻，贮藏备用；c）注意不要破坏闭壳肌以外的组织，尤其是中肠腺（又称消化盲囊，组织呈暗绿色或褐绿色）。开壳前不能加热或用麻醉剂。5.2 冷冻贝类 在室温下，使冷冻的样 品（带壳或去壳 的）呈半冷冻状态，按 5.1 方法清洗、开壳、淋洗、S C/T 3 0 2 4-2 0 0 4取肉。5.3 取样 a)可以切取中肠腺的贝类（扇贝、贻贝、牡a等），称取2 0 0 g 贝肉后，仔细切取全部中肠腺，将中肠腺
5、称重后细切混合作为检样，注意不要使中肠内容物污染案板；b)对于尚未确定部位毒性的贝类及不易切取中肠腺的小型贝肉，可将全部贝肉细切、混合，作 为检样；c)为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作，移液管等用过的器材应在5 的次氮酸钠 溶液中浸泡 1h以上，以使毒素分解；废弃的提取液等也应用5 的次氯酸钠溶液处 理。6 提取6.1取5.3 a）处理的中 肠腺，或5.3 b)处理的2 0 0 g 贝肉置于 均质杯内，均质2 m in.6.2 加3 倍量丙酮，与样品充分搅拌均匀后，用布氏漏斗抽滤并收集提取液。对残渣以检样两倍量丙酮再次抽滤两次，合并抽滤液。6.3 将抽提液移人5 0 0 m L的磨口 烧
6、瓶中，减压浓缩（旋转蒸发器，5 6 r-）去除丙酮，直至在液体表面分离出油状物。6.4 将浓缩液移入分液漏斗内，以1 0 0 ml-2 0 0 m L乙醚和少量的水洗下粘壁部分，轻轻振荡（不能生成乳浊液），静置分层后，去除水层（下层），用相当乙醚半量的蒸馏水洗乙醚层两次，再将乙醚层移人2 5 0 m l、的磨口 烧瓶中，减压浓缩（旋转蒸发器，3 5 C）去除乙醚。6.5 以少量乙醚将浓缩物移入1 0 0 m l.磨口烧瓶中，再次减压浓缩去除乙醚。6.6 以1 吐温-6 0 生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释到1 0 m L。此时1 ml、试液相当于2 0 g去壳贝肉的重量，以此悬浮液作为试验
7、原液。6.7 以试验原液注射小鼠，2 4 h内3 只均死亡时，需将试验原液进一步稀释，再注射小鼠。稀释前，应先振荡使溶液成均匀悬浮液，再取部分试液以1 吐温-6 0 生理盐水稀释。7 小 鼠试验以振荡器使试液或其稀释液成为均匀的悬浮液。将每只小鼠称重，每三只小鼠为一组，分别将 1 m L 试液注射到小鼠腹腔中。同时，另取三只小鼠作为对照组，注射1 m L1 吐温-6 0 生理盐水于腹腔中。观察自注射开始到2 4 h 后的小鼠存活情况，求出一组三只中死亡两只及两只以上的最小注口门八0，了7了下了了了射量。7.5 小鼠注射腹泻性贝毒后的症状为运动不活泼，大多呼吸异常，致死时间长。8 结果计算和表述
8、8.1 毒力的计算 使体重1 6 g-2 0 g 的 小鼠在2 4 h 死亡的 毒力为1 个小鼠 单位（M U)o 样品中D S P 毒力的计算，按表1 选择2 4 h 内死亡两只及两只以上鼠的最小注射量及最大稀释倍数进行计算。8.2 注射里与毒力的关系 注射量与毒力的关系见表 1 0s c/T 3 0 2 4-2 0 0 4表 t 注射里与毒力的关系试验液注射量 mL检样量“毒力MU/g92010切55 原液 原液 2 倍稀释液 2 倍稀释液 4 倍稀释液 4 倍稀释液 8 倍稀释液 8 倍稀释液 1 6 倍稀释液 1 6 倍稀释液以中肠腺为检样时，1.2 50.6 2 5相当于含有中肠腺的
9、去壳贝肉量。S c/T 3 0 2 4-2 0 0 4 附录A （资料性附录）本标准与日本厚生省标准的技术差异及原因表A.1 为本标准与口 本厚生省标准的技术差异及原因一览表。表A.1 本标准与日 本厚生省标准的技术差异及原因本标准的章条技术性差异原因封面、前言、标准的全文 原方法标准的格式与此完全不同 文 字叙述中有部分改动，将原文，I，的大段文字修改为逐条叙述 原标礁为“必要时，对试验溶液可做进一步稀释”，现改为“以试验原液注射鼠时，2 4 h内3只均死亡时，需将试验原液进一步稀释，再注射鼠”标准格式采用 G B/r 1.1-2 0 0 0 的规定5 章 一9章 按 G B/T 1.1-2 0 0 0的要求，将标准条文细化，使其更有逻辑性、更有条理，使用便捷更清楚说明需要稀释时的情况，便于试验时的操6 7