1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验犆 狅 狊 犿 犲 狋 犻 犮 狊 犲 犿 犫 狉 狔 狅 狋 狅 狓 犻 犮 犻 狋 狔犪 狀 犱犱 犲 狏 犲 犾 狅 狆 犿 犲 狀 狋 犪 犾 狋 狅 狓 犻 犮 犻 狋 狔狅 犳犿 犻 犮 犲犲 犿 犫 狉 狔 狅 狀 犻 犮 狊 狋 犲 犿犮 犲 犾 犾 狋 犲 狊 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国
2、标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年 月第一版 年 月第一次印刷印数 书号：定价 元书书书前言本标准的附录、附录、附录、附录 为资料性附录，附录为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中山大学。本标准主要起草人：程树军、项鹏、焦红、陈蕊、秦瑶、温巧玲、许崇辉、潘芳。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验范围本标准规定了化妆品胚胎和发育毒性小鼠胚胎干细胞试验的试验原理、试验准备、试验方法、结果和报告。本标准适用于化妆品原料化学品潜在胚胎毒性的筛选和检测。本
3、标准为胚胎和发育毒性的动物试验的替代方法之一，结合其他替代试验或动物试验用于化学物质毒性的整体评价。本标准也可供制药、农业、工业化学物质、食品添加剂和其他污染物胚胎和发育毒性试验的参考。术语和定义下列术语和定义适用于本标准。胚胎干细胞 犲 犿 犫 狉 狔 狅 狀 犻 犮 狊 狋 犲 犿犮 犲 犾 犾 狊，犈 犛来源于胚胎内细胞团或原始生殖细胞，能无限分裂并保持未分化状态，具有向胚胎三个胚层来源的所有细胞分化的能力。胚胎体 犲 犿 犫 狉 狔 狅 犻 犱犫 狅 犱 犻 犲 狊，犈 犫 狊在体外培养环境中，胚胎干细胞培养体系中撤除抑制细胞分化的因子，胚胎干细胞就会失去保持未分化状态的能力，可以自发
4、形成多细胞结构，即胚胎体，胚胎体中含有内胚层、中胚层和外胚层个胚层的细胞。分化犱 犻 犳 犳 犲 狉 犲 狀 狋 犻 犪 狋 犻 狅 狀分化是一个过程。在分化的过程中，细胞内一些特定的基因开始表达，而其他基因并不表达，从而一个非特化的细胞特化成为一个具有特殊结构并执行一定功能的细胞。成纤维细胞 犳 犻 犫 狉 狅 犫 犾 犪 狊 狋是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起，细胞的形态结构可随其功能状态的不同而改变。胚胎毒性 犲 犿 犫 狉 狔 狅 狋 狅 狓 犻 犮 犻 狋 狔外源性化学物直接或间接地作用于胚胎产生胚胎毒作用，表现为妊娠着床前早期或着床后阶段胚胎的自动丢失，
5、如吸收、流产、死胎和整个胚胎或器官和系统生长发育迟缓等。小鼠白血病抑制因子犿 犻 犮 犲 犾 犲 狌 犮 犽 犲 犿 犻 犪 犻 狀 犺 犻 犫 犻 狋 狅 狉 狔犳 犪 犮 狋 狅 狉，犿 犔 犐 犉用于维持小鼠胚胎干细胞增殖和未分化的状态的一类生长因子。悬滴培养犺 犪 狀 犵 犻 狀 犵犱 狉 狅 狆犿 犲 狋 犺 狅 犱用于诱导胚胎干细胞分化为胚胎体样结构的一种细胞培养方法，以观察细胞生长和发育过程。犛 犖犜 半数抑制浓度 犐 犇 抑制 细胞分化为心肌细胞 的受试物浓度。胚胎干细胞半数致死浓度 犐 犆 犈 犛 细胞生长和活力抑制 的受试物浓度。成纤维细胞半数致死浓度 犐 犆 犜 成纤维细
6、胞生长和活力抑制 的受试物浓度。试验原理胚胎毒性试验或用妊娠动物在体内进行，或用培养的胚胎以及来自妊娠动物的胚胎组织或细胞在体外进行。这几种体内和体外试验必须以牺牲动物为代价。本试验基于胚胎毒性作用中最重要的指标，即受试物对胚胎和成体组织的毒性损伤存在敏感性差异，这种差异与分化的抑制程度密切相关，胚胎干细胞（）对毒性物质的反应比成体细胞更为敏感。本试验采用两个永生化的小鼠细胞系：为小鼠胚胎干细胞，代表胚胎组织；为成纤维细胞，代表成体组织。细胞在白血病抑制因子（）存在的情况下能保持未分化状态，在适当条件下 细胞具有形成胚胎体和分化成主要的胚胎组织的能力。通过评价抑制胚胎干细胞分化的能力和抑制 、
7、细胞生长的能力，预测受试物的潜在胚胎毒性。试验材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸水或超纯水，试剂最好选用进口试剂。细胞 胎鼠成纤维细胞（细胞）：来源于 小鼠，最好来源于美国标准生物品收藏中心（，）。小鼠 细胞（）：推荐 细胞系，来源于 小鼠，最好来源于 （）；如有充分证明，也可使用其他细胞系，如 （）。欧洲细胞培养物保藏中心（，）。细胞培养基制备 常规培养基检测培养基：胎牛血清（）、谷氨酰胺、青霉素、链霉素。冻存培养基：、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、。完全培养基：、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、疏基乙醇、，保存不超周，用于 细胞维持未分化状态。检测培养基：、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、疏基
8、乙醇。冻存培养基：、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、疏基乙醇、。试验试剂 ：高糖，推荐 公司或 公司的产品。谷氨酰胺。胎牛血清（）：加热灭活 。犛 犖犜 小牛血清：加热灭活 。胰酶 （）：配成 。青霉素链霉素双抗：青霉素（），链霉素（）。二甲基亚砜（）：用于非水溶性化学品溶剂，或用于冻存细胞。非必须氨基酸（，）。疏基乙醇（，）：工作液浓度为 ，可用 配制，下可保存周。小鼠白血病抑制因子（）：原液浓度为 的 ，保存，融解后保存在，可保持活性约年；原液浓度为 的 ，可用 （含 ）或培养基按 稀释后保存在 或。噻唑蓝，（，），。异丙醇（或 ）。十二烷基硫酸钠（），又称月桂基硫酸钠（）：用水配成 储存液，室
9、温保存。磷酸缓冲液（）：无 和 ，保存于室温或冰箱中。氟尿嘧啶（，）：阳性对照物，以 配制，按终浓度 分装保存于。青霉素：阴性对照物，以终浓度 分装保存于。牛血清白蛋白（）：组织培养用。台盼蓝：配制成 水溶液。超纯水。无水乙醇。犕犜 犜溶液 贮存液：通常使用的浓度为 。称取 ，溶于 的磷酸缓冲液（），用 滤膜过滤除菌，避光保存。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包裹。需注意，法只能用来检测细胞相对数量和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，吸光度最好在 范围内。解吸液：的 贮存液与 异丙醇混合，使用前新鲜配制，如出现沉淀温育至。耗材 培养瓶：和
10、，用于常规培养。培养皿：和 ，用于细胞常规培养和悬滴培养。孔平底组织培养微孔板。孔组织培养板。细胞冻存管。微孔滤膜。不透光管（）或铝薄纸遮蔽管（）：用于光敏性物质溶液的配制。封口膜：用于封闭 孔板，防止化学物质挥发，如 公司（）。仪器和设备 培养箱：温度，相对湿度，。层流洁净柜（生物安全标准）。恒温水浴箱：温度。倒置相差显微镜。电子天平（精确到 ）。犛 犖犜 孔板分光光度计（酶标仪）。移液器：单通道或多通道移液器。微孔板摇床。细胞计数仪或血球计数器。离心机（最好配有微孔板转子）。试验过程 受试物溶液的制备 溶剂参照附录 把受试物溶解在合适的溶剂中。所选择的溶剂其浓度不能具有细胞毒性和对细胞分化
11、有任何影响，且该浓度在试验过程中应始终保持一致。各溶剂推荐的最高浓度 为 ，乙醇为。预试验受试物浓度范围的设置以受试物的最高溶解浓度和无细胞毒性的最高溶剂浓度作为最高试验浓度，推荐采用倍系列稀释法制备受试物浓度。正式试验受试物浓度范围的设置以 进制几何浓度序列稀释法，在梯度为 之间，按 “预试验”中确定的剂量 反应关系范围，以较小的稀释倍数制备个个试验浓度。如稀释因子 （槡）将一个 单位分成等距离的个 间 隔。稀 释 因 子 （槡）将 一 个 单 位 分 成 等 距 离 的 个 间 隔。稀 释 因 子 （槡）将一个 单位分成等距离的个间隔。稀释因子 （槡）将一个 单位分成等距离的 个间隔。以因
12、子 作为例子。加入 体积的稀释液稀释体积最高浓度的溶液，混合均匀，取一体积此溶液加入 体积的稀释液，依次同样操作次，即可得到以 为稀释因子的十进制序列稀释液。正式试验应设个浓度的阳性对照物质（见 ）。注意事项受试物制备应注意以下几点：）任何化学物质的最大试验浓度是 ；）不要使用 完全培养基制备受试物贮存液，因为血清蛋白质、受试物或其他成分可能在反复冻融中出现沉淀；）提前制备贮存液，包括阳性对照物 氟尿嘧啶、双抗、阴性对照物青霉素 等可以冻存于；）强酸和强碱化学物质可能影响培养基的缓冲能力，因此受试物溶解后，应目测检查最高浓度受试物培养基的 值，如变紫或浅黄（或 ），表明培养基缓冲能力下降，贮存
13、液应用 氢氧化钠或 盐酸中和；）受试物如对光线敏感，应避免长时间曝露于光线（如显微镜）下，应在更换培养基前在显微镜下观察细胞。采用不透光管或铝薄包裹的遮蔽管配制溶液；）对挥发性受试物，应在受试物处理完培养板后，立即用可透过 但不能透过挥发性受试物的封口膜覆盖后再盖上板盖；）对未知受试物进行细胞毒性试验（见）前，应测定含最高受试物浓度的检测用培养基（方法：加 液于 。含最高受试物浓度的检测用培养基中，、孵育）在 处的绝对光密度（）值，以排除化学物可能与 发生的化学反应。测得的 值应 。如 值小于此值，而且所代表的浓度恰好在预期的 范围内，那么在试验的第，加 前，应把培养板上除空白外的所有培养孔中
14、的培养基换成不含受试物的检测用培养基。犛 犖犜 犿 犈 犛细胞分化能力检测 犿 犈 犛细胞悬液制备 细胞的维持培养参见附录。为防止 细胞贴壁，用 培养皿制备浓度约为 个细胞 的 细胞悬液。用台盼蓝染色法检查 细胞的细胞活力，如活力 则细胞用于试验。试验过程中应不断轻微晃动细胞以保持细胞处于悬浮状态，并尽可能缩短培养箱外停留时间。试验程序（参见附录犆）第一步（第天）：悬滴培养，犿 犈 犛细胞集落形成根据 的方法将受试物溶于适当溶剂（如 检测培养基）中，制备不同浓度的受试物溶液（每个浓度用一个培养皿）。然后加入制备好的 细胞悬液，浓度为 个细胞。用移液器吸取 含一定测试化学物的细胞悬液（约 个细胞
15、）于 组织培养皿的盖子内，每个盖子加 滴 滴，每个浓度的化学物用一个培养皿盖，空白对照组（检测培养基）和溶剂对照组也一样。小心翻转盖子于正常位置，培养皿中加 。培养箱悬滴培养。第二步（第天）：细胞悬浮培养，胚胎体形成制备不同浓度的受试物溶液，每一个浓度的测试化学物、空白对照（检测培养基）、溶剂对照分别各自使用一个培养皿。吸取 含适当浓度受试物的培养基或溶剂于“悬滴”培养皿盖中，将培养盖倾斜约 以使胚胎体（）滑落底部，用 移液器（避免损伤 ）轻轻将所有细胞悬液转移至 培养皿。注意“悬滴”中的化学物浓度与培养皿中的保持一致。培养箱继续培养。第三步（第天）：孔板培养，心肌细胞分化制备不同浓度的受试物
16、溶液，每一浓度的测试化学物、空白对照和溶剂对照分别各自使用一个 孔板。往 孔板的各孔中加入 同一浓度的测试溶液。用吸头以约 体积每孔加个 。注意确保含 的测试溶液的与培养板孔中的测试溶液浓度一致。培养箱培养。结果观察试验第 时，相差显微镜下仔细观察每个培养板各孔含自主收缩心肌细胞的孔数，并记录。质量控制 一般要求重复试验至少次（次有效试验），第次试验时，应另外配制试剂。细胞质量控制分化期末（第 ）检查溶剂对照板，如果 个 中至少 个已分化为自主收缩的心肌细胞，则试验结果可接受。比较空白对照板数据（检测培养基）和溶剂对照板的数据可确定溶剂对 分化有无影响。如果使用了最高允许浓度的溶剂，则溶剂对照和空白 检测培养基对照都要设置。检测过程的质量控制（阳性对照）一批新的冻存细胞解冻后和新的化学物测试前，应采用氟尿嘧啶为阳性参照物进行检测过程的质量控制。以 细胞测定 的值。最终检测浓度是 、，从 贮备液开始稀释。的值应该在 的范围内。犉 犆 犛的质量控制每批 都要在无化学物质下进行分化能力测试，结果应是 孔中至少 孔出现心肌细胞，并重复次，而且应是在细胞质量良好的情况下进行。完成血清测试后，作为