1、SN中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 5 3 6 一 1 9 9 6出口肉品中卡那霉素残留量检验方法 杯碟法Me t h o d f o r t h e d e t e r min a t io n o f k a n a m y c i n r e s i d u e s in m e a t f o r e x p o r t -C y l i n d e r p l a t e me t h o d1 9 9 6 一 0 4 一 2 9 发布1 9 9 6 一 1 0 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出口商品检验局发 布S N 0 5 3 6-1 9 9 6前台 本标准
2、是根据 G B/T 1.1-1 9 9 3 标准化工作导则第 1 单元:标准的起草与表述规则第 1 部分:标准编写的基本规定及 S N/T 0 0 0 1-1 9 9 5 出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定的要求而编写的、其中测定方法采用了日 本厚生省1 9 9。年编集的 畜、水产 食品中的 残留物质检验方法 中卡那霉素检验方法。技术内容与原方法相同，经验证后，按规定格式要求作了编辑性修改。在标准中同时制定了抽样和制样方法。本标准的附录A是标准的附录。本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国浙江进出口商品检验局。本标准主要
3、起草人:施伟良、张蓉。本标准系首次发布的行业标准。中 华人民共和国 进出口 商品检验行业标准出口肉品中卡那霉素残留量检验方法 杯碟法S N 0 5 3 6 一1 9 9 6Me t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f k a n a my c i n r e s i d u e s i n me a t f o r e x p o r t -C y l i n d e r p l a t e me t h o d范围本标准规定了出口肉品中卡那霉素残留量检验的抽样、制祥和杯碟测定法。本标准适用于出口禽肉中卡那霉素残留量的检验。抽样和制样2
4、.1 检验批 以不超过 2 5 0 0 件为一检验批。同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2 抽样数量 批量，件最低抽样数，件 1-2 5 1 2 6-1 0 0 5 1 0 1-2 5 0 1 0 2 5 1-5 0 0 1 5 5 0 1-1 0 0 0 1 7 1 0 0 1-2 5 0 0 2 02.3 抽样方法 按 2.2 规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品，抽取的原始样品总量不少于 2 k g，放入清洁容器内，加封后，标明标记及时送交实验室。如每件中 无小包装或有小包装但每袋重量超过2 k g 者，则可用灭菌刀具在抽出的
5、包件中，每件 割取不少于1 0 0 g 样品，混合后置清洁容器内，作为混合原始样。混合原始样的总量不少于2 k g。加封后，标明标记，及时送交实验室。2.4 试样制备 从取回的原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放人绞碎机中绞碎，充分混匀。用四分法缩分出 不少于5 0 0 g 作为试样。装 入清洁容器内，加封后标明 标记。2.5 试样保存 将试祥于一1 8 C以下冷冻保存。注:在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 6-0 4-2 9 批准1 9 9 6-1 0-0 1实施 IS N 05 36 一 1 99 6测
6、 定方 法3.1 方法提要 用磷酸盐缓冲液抽提试样中残留的卡那霉素，经均质、离心，取上清液进行杯碟法测定。利用被测定样液中的残留卡那霉素与枯草杆菌的作用，产生抑菌圈，从抑菌圈大小用标准曲线法进行定量测定。3.2 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。2.1 卡那霉素标准品:7 7 5 I a g/m g，由中国药品生 物制品检 定所提供。2.2 缓冲液 I(p H 6.。士。.1);称取3.5 g 无水磷酸二氢钾及1 6.7 3 g 无水磷酸氢二钾溶于水中，定，d容 1 0 0 0 mL,1 2 1 高压灭菌 1 5 m i n,3.2.3 缓冲液 II(p H 8.。士。
7、.ll:称取1 3.3 g 无水磷酸二氢钾及6.2 g 氢氧化钾溶于水中，定容1 0 0 0 m L,1 2 1 0C 高压灭菌 1 5 m i n,3.2.4 缓冲 液II(p H 7.9 士。.1):称取0.5 2 3 g 无水磷酸二氢钾及1 6.7 3 g 无水磷酸氢二钾溶于水中，定容 1 0 0 0 mL,1 2 1 高压灭菌 1 5 m i n,3-2.5 试验菌种:枯草芽抱杆菌(B a c i l l u s s u b t il i s)，由中国药品生物制品检定所提供，菌株号 6 3 5 0 1,3.2.6 生理盐水:称取 8.5 g 氯化钠，溶解于 1 0 0 0 mL水中，1
8、 2 1 C 高压灭菌 1 5 m i n,3.2.7 卡那霉素标准储备 液:准确称取适量的卡那霉素标准品，精确到士。1 m g，用缓冲 液 工(3.2.2)溶解并定容至1 0 0 0 p g/m L,置4 冰箱保存，可使用一个月。3.2.8 卡那霉素标准工作液:吸取一定量卡那霉素标准储备液，用缓冲液 II(3.2.3)稀释成。.2 5,0.5,1.0,2.0 K g/m L的标准 工作液。以上溶液均须当日 配制和使用。3.2.9 培养基 保存及增菌用 培养基(见附录A中A D.基层及菌种用培养基(见附录 A中 A 2),3.3 仪器和设备3.3 门培养皿:内径 9 0 mm，底部平整光滑的玻
9、璃皿或塑料皿，具陶瓦盖。3.3.2 牛津杯:不 锈钢管，外径(8.0 士0.1)m m，内径(6.0 士0.1)m m，高度(1 0.0 士0.1)m m,13.3 游标卡尺:测 量范围。2 0 0 m m，精度0.0 2 m m,13.4 绞碎机:电动。3.3.5 均质器:不低 于1 0 0 0 0 r/m i n,13.6 离心机:不低 于4 0 0 0 r/m in,3.3.7 恒温培养箱:(3 6 士1)0C，搁板应保持水平。3.3.8 高压灭菌器。3.3.9 恒温水浴锅。3.3.1 0 其他:实验室常用玻璃器皿。3.4 测定步骤3.4.1 样液制备 称取 2 0.0 g 试样于均质杯
10、内，加入2 0 mL缓冲液 11(3.2.4),搅匀，放置 6 0 m i n，均质2 m i n(1 0 0 0 0r/m i n)后，移入离心管中离心3 0 min(4 0 0 0 r/m i n)。取上清液检查p H，必要时用1 mo l/L氢氧化钠溶液调节 p H至 7.9 士。.1，此溶液作为样液。3.4.2 芽胞悬液的制备 取适量生 理盐水(3.2.6 功口 人已 培养 好的枯草杆菌6 3 5 0 1 试管斜面中，制成悬液。取1 m L悬液涂布于装有增菌用 培养基(见附录A中A ll的克氏瓶中，置培养箱(3 6 士1)培养7 天。镜检芽抱数达8 5%以上，用适量生理盐水洗下菌苔，置
11、于(6 5 士1)恒温水浴中加热 3 0 m i n,经离心(3 0 0 0 r/mi n)S N 4 536 一 1 99 62 0 mi n，弃去上清液。再加生理盐水洗涤，经离心后弃去上清液，如此重复洗涤芽抱悬液三次。置常温2 4 h 后再置于(6 5 士ll 恒温水浴中 加热3 0 m i n，然后用适量生 理盐水制成芽抱悬液。置4 冰箱中 可保存数月。3.4.3 芽胞悬液用量的确定 在实际测定前，应先用。.2 5 k g/m L卡那霉素标准工作液对加有不同量的芽胞 悬液的平板进行预测试，经培养后能使。.2 5 p g/m L标准 工作液产生直 径)1 0 m m清晰、完整的 抑菌圈的
12、最佳芽胞悬液用量。3.4.4 检定用平板 注入 1 0 m L基层培养基(见附录A中A2)于灭菌培养皿内，水平静置，使其凝固。将基层培养基(见附录 A中 A 2)熔化，冷却至 5 0 左右，加入适量(从 3.4.3测得)的芽胞悬液使之充分混合后，取约7 m L 注入已铺有基层培养基的平板中，保持水平，使其凝固。所用平板须当天制备。3.4.5 标准曲线的制备 用卡那霉素标准工作液(3.2.8)制备标准曲线，以。.5 p g/m L 浓度的标准 工作 液为 参考浓度。每个标准工作液浓度取三个检定平板作为一组，每个平板上置4个牛津杯，使牛津杯在半径为2.8 c m的圆面成9 0。角间 距，对角两个杯
13、加。5 ji g/m L参考浓度标准工作液，另两个对角 杯加 其他浓度的一种标准工作液。4 个浓 度标准 工作液 共 1 2 个检定平板，用于制备标准曲 线。其中。5 p g/m L参考浓度的标准工作液将得到 2 4个数值，而其他标准工作液分别得到6个数值。将瓦盖盖好，置(3 6 士1)培养(1 7 士llh.经培养后，翻转平板，除去牛津杯，精确地测量各个浓度的抑菌圈直 径(精确到。.1 m m)，求得各自 的平均值，再求出。.5 fa g/m L 参考浓度2 4 个抑菌圈直径的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值减去每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值的差，即为各该组平板的 校正值。将校正
14、后的值用式(1)和式(2)算出L 和H点的直径，在 半对数坐标纸上，以抑菌圈直径为横坐标(算术 级)，卡那霉素浓 度为纵坐标(对数 级)，通过L和H点连一直线即为标准曲线。L二(7 a+4 b 十c 一 2 d)/1 0 ，。(1)H=(7 d+4 c十 b一 2 a)/1 0 。(2)式中:L标准曲线上最低浓度抑菌圈的直径;H标准曲线上最高浓度抑菌圈的直径;b 参考浓度。.5 p g/m L 的2 4 个抑菌圈直径的平均值，M M;a,c,d 分别表示标准曲 线中其他标准浓度(0.2 5,1.0,2.0 K g/m L)的抑菌圈直径经校正后的 平均值，m m,3.4.6 样液的测定、”每份样
15、液取 3 个检定平板，在每个平板上置 4 个已灭菌的牛津杯(按制备标准曲线方法放置)，在对角的 2只牛津杯里注满试验样液，在剩余的 2只牛津杯里分别注满卡那霉素标准工作液(高稀释度。.2 5 I g/m L 及参考浓度。.5 p g/m L)。于(3 6 11)下培养(1 7 11)h，然后翻转平板，除去牛津杯。如有抑菌圈产生，准确量取抑菌圈直径(精确到 0.1 m m),I5 结果的计算和表述 如样液抑菌圈的直径1 0 m m，求出每组三个检定平板上样液和参考浓度标准工作液抑菌圈直径的平均值，经校正后，从标准曲线上查出 相应的卡那霉素的 浓度，通过式(3)，计算试祥中 卡那霉素残留量:X=二
16、X 1 0 0 0.，.(3)式中:X试样中卡那霉素残留的含量,m g/k g;从标准曲线 上查出样液中卡那霉素浓度，1 g/m L;S N 0 5 3 6 一 1 9 9 6 m每毫升最终样液所代表的试样量，9。注:如测定结果呈阳性，即所显抑菌圈直径的平均值)1 0 m m时，必要时，尚需进行确证试验(可用薄层色谱法)，以 证明抑菌物确系卡那霉素.4 测定低限和回收率4.I 测定低限 本方法的测定低限为。.5 m g/k g,4.2 回收率 回收率实验数据:卡那霉素添加浓度在0.5 K g/g时，回收率为 8 3.7 肠;卡那霉素添加浓度在1。k g/g 时，回 收率为9 1.5%;卡那霉素添加浓度在2.0 k g/g 时，回 收率为9 7.0 0 0,S N 0 5 3 6 一 1 9 9 6 附录A (标准的附录)培养墓成分 及制 备方法A 1 保存及增菌用培养荃 蛋白 脉1 0.0 g 牛肉 浸膏5.0 9 氯化钠2.5 9 琼脂1 3 -1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 m L 将上述成分于蒸馏水中加热溶解，调节 p H使其灭菌后 p H为 6.5 士。.1，分装于试管或克氏