1、SN中华人民共和国出人境检验检疫行业标准s N/T 0 7 6 4 一 1 9 9 9出口家禽新城疫病毒检验方法I n s p e c t i o n m e t h o d o n n e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s i n p o u l t r y f o r e x p o r t1 9 9 9 一 0 5 一 0 5 发布1 9 9 9 一 0 8 一 0 1 实施中华人民共和国国家出人境检验检疫局批 准s v/T 0 7 6 4-1 9 9 9前言 本标准是根据G B/T 1.1-1 9 9 3 标准化工作导则 第1 单元:标准起草与
2、表述规则 第1 部分:标准编写的 基本规定 的要求进行编写的。其中 病毒 分离鉴定、脑内接种致病指数(I C P I)、静脉内 接种致病指数(I V P D、鸡胚平均死亡时间(M D T)的测定方法等同采用国际兽医 局 动物疾病诊断方法和疫苗使用标准手册 的方法，并根据实际，使之进一步具体化，同时制定了抽样和制样方法.本标准由中 华人民 共和国国 家出 入境检验检疫局提出并归口。本标准由中 华人民 共和国山 东进出口 商品检验局负责起草。本标准主要起草人:管恩平。中华人民共和国出人境检验检疫行业标准出口家禽新城疫病毒检验方法I n s p e c t i o n m e t h o d o n
3、 n e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s i n p o u l t r y f o r e x p o r tS N/T 0 7 6 4 一 1 9 9 9范围本标准规定了出口家禽样品的采集、新城疫病毒分离、毒力检验鉴定、检验方法和结果判定等.本标准适用于出口家禽新城疫病毒的检验鉴定。术语 新城疫是家禽的一种急性传染病。其病原新城疫病毒(N D V)是副粘病毒属的副粘病毒 I 型。该病毒多呈圆形，直 径 1 0 0 -5 0 0 n m,基因组为单股R N A，可凝集人、鸡、小鼠 等多种动物的红血球(R B C),S P F 鸡胚:将无特定病原(S
4、 P F)鸡所产的受精蛋孵化到试验要求的日 龄。判定所分离新城疫病毒毒力的指标为:对鸡胚平均致死时间(MD T)，对 1日龄小鸡的脑内接种致病指数(I C P I)或者对 6 周龄小鸡的静脉接种致病指数(I VP I),对强毒力的新城疫病毒,MD T l.6,I V P I 可达3.0.对中等毒力的新城疫病毒,6 0 h M D T 9 0 h,0.6 IC P I 9 0 h,I C P I 0.4,I V P I 可为。H A与H I 效价用 2 的指数次方表示，如 2 7，即 1:1 2 8,HA效价表示病毒的血凝活性，HI 效价表示抗血清的血凝抑制活性。出口 家禽中 主要是肉 鸡检测新
5、 城疫病毒，本方法描述时以鸡为主要对象，其他家禽N D V检测方法同本法。器材与试剂器材 仪器:分析夭平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压消毒器、微量移液器、滴头、血3313.1凝反应板、孵化 箱、出 雏箱、培养皿、牙 签、医用脱脂棉、有盖玻瓶、注射器(1 m L)、注射针头(V 号)、干烤箱。3.1.2 试剂:磷酸二氢钠(A R),磷酸氢二钠(A R),氯化钠(A R)、青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素、营养琼脂(AR),葡萄搪(AR)、柠檬酸钠(2 1-1 2 0)(A R),蒸馏水。3.1.3 S P F鸡胚(9-1 1日龄),1日龄S P F鸡.6 周龄 S P F鸡(
6、购自国家认可的S P F鸡场)。3.2 试剂配制3.2.1 棉拭子准备:将脱脂棉缠于牙签的钝端，使其形成直径0.4 c m的脱脂棉球。然后用牛皮纸包扎，每捆 1 0只，1 2 1 高压 1 5 mi n，备用。3.2-2 p H7.2 磷酸缓冲液(P B):由0.1 5 m o l/L的A,B两液组成.A液:磷酸氢二钠(N a,H P O,1 2 H O)3.9 3 g 加蒸馏 水至7 3 m L,中 华人民共和国国家出人境检验检疫局1 9 9 9 一 0 5 一 0 5 批准1 9 9 9 一 0 8-0 1 实施 Is N/T 0 7 6 4 一 1 9 9 9 B 液:磷酸二氢钠(N a
7、 H z P O,2 H 2 0)0.6 3 g 加 燕馏水至2 7 m L,将A,B 液混合即成1 0 0 m L p H 7.2 P B,1 2 1 C 1 5 m i n 高压 灭菌。3.2.3 生 理盐水:抓化钠8.5 g 加蒸馏水 至1 0 0 0 m L,1 2 1 C 1 5 m i n 高压灭菌。3.2.4 阿氏液(R B C保存液)葡萄糖:2.0 5 g;柠檬酸钠(2 H 2 0):0.8 0 g;抓化钠:。4 2 g;蒸馏水:1 0 0 m L,溶解后，以1 0%柠檬酸调节p H至6.1，过滤，分装，在4.5 4 k g 压力下灭菌1 0 m i n，在4 条件下 保存。作
8、抗凝和保存R B C 用。3.2.5 1 0 0 鸡 R B C悬液:采集健康公鸡的抗凝血液加入三至四倍量生理盐水，轻柔洗涤三次，2 0 0 0 r/m i n 分别离心1 5 m i n，去掉血清、白 细胞、血小板和淋巴细胞，吸取压积R B C加生理盐水配成1 Y o(v/v)R B C悬液。3.2.6 标准新城疫病毒 购人的标准新城疫病毒应检测其H A效价并进行无菌检验，以检查与所标H A效价是否相符。若不符，应重复检测并到相关实验室验证。3.2-6.1 HA操作(按 R微量法)在9 6 孔v 型微量血授反应 板上，自 第一孔至第十一孔每孔加入5 0 p L生理盐水。然后再在第一孔中 加入
9、待检病毒5 0 p L第十一孔为R B C对照(阴 性对照)。第十二孔加入标准新城疫病毒(阳 性对照)。从第一孔开始用移液器作等量倍比 稀释至第十孔，第十孔弃去5 0 p L,每孔各加入1%鸡R B C悬液5 0 p L，立即在 微型振荡器上 摇匀，置2 0 C 温 室4 5 m i n，即阴 性对照孔R B C完全沉淀后判定结果。HA效价高于 2 “时可继续增加稀释的孔数(见表 ll,表 1 HA试验孔 号1234567891 01 1 1 2 稀释倍数V 2 z 2 0 2 2 2 2 2 s 2 2 0.8 5 肠生理盐水.tL L50 50 50 50 50 50 50 50 50 5
10、0 5050 50 50 50 50 50 50 50 50 50 -50 二检样.A L1%鸡R B C,p L5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0感 作2 0 C 4 5 min结 果 举 例#样+十一一一1)为R B C对照;2)为标准新城疫病毒对照#为完全凝集，+和十为不完全凝集，一为不凝集;凡能使鸡R B C完全凝集的病毒最高稀释倍数为该病毒的血凝效价.如表血凝效价为 2 ，即 1:1 2 8,s N/T 0 7 6 4 一 1 9 9 93.2-6.2 结果判定 血凝程序以#、十+、+、+、一表示。#R B C均匀铺于孔底;
11、+十十基本同上，但边境不整齐，有下垂趋向;+十RB C在孔底，形成一个环状，四周有小凝结块;十R B C于管底形成一个小团，但边缘不光滑s-R B C于孔底形成小团，边缘整齐、光滑。结果以#为凝结终点，即能完全凝集鸡 R B C的最高稀释度为该待检病毒样品的血凝价.3.2.7 4 个血凝单位的病毒制备 根据 3,2.6 测定的病毒的血凝效价，判定 4 个血凝单位病毒的稀释倍数。方法举例为:如病毒HA效价为2 ，其4 单位病毒H A效价为2 7，则将病毒稀释1 2 8 倍即可。3.2.8 标准的 抗新城疫病毒血凝抑制抗体(血清)购入的标准抗新城疫病毒血凝抑制抗体(血清)应检测其H I 效价，以
12、检查与所标H I 效价是否相符。3.2.8.，H I 试验(按R 微量 法)在9 6 孔V 型血凝反应板上，每孔各加入5 0 p L生理盐水;第一孔加入5 0 t A L 血清，倍比 稀释至第 十孔，第十孔弃去5 0 K L，第十二孔加入标准血清5 0 F A L;然后每孔加入5 0 W L 4 个血凝单位的标准新城疫病毒到 第十一孔，立即在微型振荡器上摇匀，置2 0 室温3 0 m i n;然后每孔各加入5 0 p L l 写 鸡R B C 悬液，摇匀置 2 0 室温4 5 mi n,HI 效价高于 2 1o 时可继续增加稀释的孔数。即阴性对照孔 R B C完全沉淀后判定血凝抑制效价(见表
13、2),表 2 H I 试验孔号1234567891 01 1 1 2 稀释倍数2 1 2 s 2 3 2 2 2 2 7 2 e 2 2 1 00.8 5 纬生理盐水 1.L一:50 50 50 SO 50 50 50 50 5I I I I l I 1 I I 50 50 50 50 50 50 50 50 5一)SO 一血清,IA L4 单位病毒，;A L5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0一感作2 0 C 3 0 min1%鸡R B C,p L5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0感
14、 作2 0 C 4 5 min结果举例一一一一一一一抹#抹#一1)为标准新城疫病毒对照;2)为标准血清对照;#为完全凝集，+和十为不完全凝集，一为不凝集，凡能使4单位病毒凝集鸡R B C的作用完全抑制的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制效价.如表血凝抑制效价为 2 ，即1:1 2 8.3.2-8.2 结果判定 血凝程序以#、十十+、+、+、一表示，判定方法同 3.2.6.2。结果以一为血凝抑制终点，即能完全抑制鸡R B C凝集的血清最高稀释度为 该血清的血凝抑制效价。一般取血凝抑制效价2 s 至2，的血 清做本试验.S N/T 0 7 6 4一 1 9 9 9取样4.1 样品采集 在屠宰前对每
15、群鸡随机采集泄殖腔棉拭样品(去粪便，刮取泄殖腔粘膜)不少于 6 0只，装入盛有1 mL P B S(p H7.2)的玻瓶中，盖好瓶塞，并标记清楚(编号，采样时间，鸡群编号)，立即于一3 0 冻结保存。4.2 样品处理 将冻结样品冻融 两次，用力振荡青霉素瓶，迫使棉拭子释放其所吸附内容 物，去掉棉拭子1 O O O G离心1 5 m i n。用于接种鸡胚分离病毒的 上清液中应按5 0 0 0 I U/m L青霉素,1 0 m g/m L链霉素,2 5 0 F a g/m L 卡那霉素和5 0 0 0 I U/m L制霉菌素的浓度加入青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素，调节p H为7.0-7.4,
16、4 作用4h，以确保无菌。一3 0 冻存。5 操作步骤5 门 病原分离5.1.1 细菌污染检查 将处理好的泄 殖腔棉拭样品上清液接种于灭菌的普通营养琼脂平板上，3 7 温箱孵育2 4 h,检查有无细菌生长。当有细菌生长时，应按4.2 法，进一步作无菌处理。5，.2 操作步骤 将每份无菌的泄殖腔棉拭样品上清液用注 射器(1 m L)尿囊腔接种至少 5 枚9 1 1 日 龄的S P F 鸡胚.每胚。2 m L,3 7 继续孵化4-7 d，弃去2 4 h内 死亡的 鸡胚,2 4 h 以后死的和濒 死的以 及结束培养时活下来的鸡胚置4 冰箱4 2 4 h后收其尿囊液。取澄清无菌尿囊液作HA试验，测尿囊液的 H A活性(方法同3.2.6)。阴性者，将尿囊液冻结保存。用S P F鸡胚再传代一次，然后再测尿囊液的HA活性;通常盲传2-3 代。H A效价低 于2 视为 未分离出新城疫病毒。5.1.3 4 个血凝单位的尿囊液病毒制备 根据 5.1.2 测定的尿囊液的血凝效价，判定 4个血凝单位病毒的尿囊液的稀释倍数(方法同3.2.7).5.1-4 H I 试验 方法同3.2.8。判定尿囊液中的病毒是否为