1、ICS 65.020.30 B 43 DB12 天津市地方标准 DB12/T 9562020 奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法 Determination of total coliforms,fecal coliforms and Escherichia Coli in dairy farm manure Enzyme substrate method 2020-08-18 发布 2020-10-01 实施 天津市市场监督管理委员会 发 布 DB12/T 9562020 1 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会
2、提出并归口。本标准起草单位：农业农村部环境保护科研监测所、军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所。本标准主要起草人：赵润、李辰宇、王景峰、张克强、谌志强、杜连柱、梁雨。DB12/T 9562020 2 奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法 1 范围 本标准规定了基于酶底物法测定规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的技术要求及操作方法。本标准适用于规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的同时测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件
3、，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 275222011 畜禽养殖污水采样技术规范 HJ 10012018 水质 总大肠菌群，粪大肠菌群和大肠埃希氏菌测定 酶底物法 3 术语和定义 HJ 10012018界定的以及下列术语和定义适用于本文件，为了方便使用，以下重复列出了HJ 10012018中的某些术语和定义。3.1 总大肠菌群和粪大肠菌群 total coliforms and fecal coliforms 奶牛场粪污中常见的肠杆菌科细菌，恒温（总大肠菌群：37；粪大肠菌群：44.5）培养后可分解选择性培养基中的邻
4、硝基苯-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色邻硝基苯酚。3.2 大肠埃希氏菌 Escherichia Coli 俗称大肠杆菌，恒温37 培养后既能够分解选择性培养基中的邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成邻硝基苯酚，同时可以分解4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放4-甲基伞形酮，在365 nm紫外光源照射下显蓝色。HJ 10012018，定义3.3 3.3 最大可能数 most probable number（MPN）一种基于泊松分布的间接计数方法。根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在数量。HJ 10012018，定义3
5、.4 4 粪污样品采集 DB12/T 9562020 3 4.1 采样物品 采样容器应使用一次性无菌容器，或经121、20 min高压灭菌处理。其余采样工具、文具、器具、防护用品按照GB/T 275222011中第4.1款规定执行。4.2 采样方法 按照GB/T 275222011中第4.4.2款的规定执行。4.3 样品保存 采样后应在低温（4）条件下保存并在6 h内完成测定。5 酶底物测定 5.1 方法原理 在选择性培养基中培养18 h24 h，总大肠菌群和粪大肠菌群能够产生-半乳糖苷酶并分解培养底物中的邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成邻硝基苯酚（ONP），该物质在白光或日光照射下
6、显黄色。大肠埃希氏菌可以分解4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放4-甲基伞形酮，在365 nm紫外光源照射下显蓝色。计数97孔板中阳性单元格出现数量，查MPN表，分别计算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的浓度值。5.2 试剂材料 5.2.1 分析时应使用符合 GB/T 66822008 中三级水规定要求的实验用水，并经 121、20 min 高压灭菌后使用。5.2.2 培养基宜采用 HJ 10012018 中第 6.1 款规定的 Minimal Medium ONPG-MUG 培养基。每 100 mL预处理后的样品应使用培养基粉末 2.7 g 0.5 g，培养基可采用市售商
7、品化培养基制品，成分见表 1。表1 培养基成分表 单位为毫克 名称 数量 硫酸铵（NH4）2SO4 500 硫酸锰（MnSO4）0.05 硫酸锌（ZnSO4）0.05 硫酸镁（MgSO4）10 氯化钠（NaCl）1000 氯化钙（CaCl2）5 亚硫酸钠（Na2SO3）4 两性霉素 B（Amphotericin B）0.1 邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）50 4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）7.5 茄属植物萃取物（Solanium 萃取物）50 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐（HEPES 钠盐）530 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）690 DB12/
8、T 9562020 4 5.2.3 97 孔定量盘：具有 48 个标准孔格，1 个大孔格和 48 个小孔格，经环氧乙烷灭菌的市售商品化成品。5.2.4 标准阳性比色盘。5.3 仪器设备 5.3.1 恒温培养箱：允许温度偏差 37 1、44.5 0.5。5.3.2 小型熨斗：用于 97 孔定量盘（5.2.3）的封口。5.3.3 移液管：一次性无菌塑料吸管，也可采用计量合格的可调式移液器。5.3.4 实验室常用仪器设备，121 高压灭菌 20 min 后备用。5.3.5 紫外灯：具有 365 nm 中心波长的光源。5.3.6 电子天平：量程大于 200 g，精度不小于 0.1 g。5.4 样品前处
9、理 使用电子天平（5.3.6）准确称量样品2 g（精确到0.1 g）或使用移液管（5.3.3）吸取样品2.0 mL按4.2中方法采集的粪污样品置于盛有198 mL生理盐水的无菌匀质袋中，手持震荡无菌均质袋2 min，静置观察样品状态，当样品中含有大颗粒固体样品时使用手指碾压粉碎并继续震荡直至样品形成悬浊液，过0.25 mm尼龙筛制成10-2稀释液。用移液管（5.3.3）吸取上述稀释液1 mL加入到99 mL无菌水中，依次稀释分别得到10-4、10-6等浓度稀释液。5.5 接种 定容制备100 mL样品或稀释样品于现场采样袋或采样瓶中，加入2.7 g培养基（5.2.2）粉末，震荡均匀并静置5 m
10、in，待培养基混匀溶解后，将样品均匀倒入97孔定量盘（5.2.3）内（保证每个孔内充满样品液），使用小型熨斗（5.2.3）从97孔定量盘（5.2.3）底部缓慢匀速熨烫至顶部，将97孔定量盘（5.2.3）完全密封。未培养前观察孔内颜色，若出现类似或深于标准阳性比色盘（5.2.4）的颜色时，应观察样品浊度，停止实验并重新取样过滤制备样品。5.6 培养 测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时，将接种后的97孔定量盘样品放入恒温培养箱（5.3.1）中37 0.5 下培养18 h后进行判读，当97孔定量盘中孔格颜色弱于标准阳性比色盘（5.2.4）时，应进一步延长培养时间至24 h再进行判读。测定粪大肠菌群时，将
11、接种后的97孔定量盘放入的恒温培养箱（5.3.1）中44.5 0.5 下培养18 h后进行判读，当97孔定量盘中孔格颜色弱于标准阳性比色盘（5.2.4）时，应进一步延长培养时间至24 h再进行判读。5.7 结果分析 5.7.1 结果判读与计数 接种培养后的97孔定量盘在日光或白色光源照射下呈黄色即为总大肠菌群或粪大肠菌群阳性；在紫外灯（5.3.5）照射下呈蓝色即为大肠埃希氏菌阳性。分别记录97孔定量盘中大孔和小孔的阳性孔数量。5.7.2 结果计算 从97孔定量盘法MPN表（见附录A）中查得每100 mL样品MPN值后，再根据样品不同的稀释度，按照公式（1）换算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群数或大
12、肠埃希氏菌浓度（MPN/L）：DB12/T 9562020 5 C=(MPN 1000)/f(1)式中：C样品浓度，MPN/L；MPN值查得每100 mL样品MPN值，MPN/100 mL；1000单位转换因子（由MPN/mL转换为MPN/L）；F最大接种量，mL；测定结果保留两位有效数字，结果大于等于100时以科学计数法表示；若97孔均为阴性，报告目标微生物未检出。5.7.3 检出限 本方法的检出限为10 MPN/L。6 注意事项 6.1 每批次实验应使用无菌水进行至少 1 次空白实验，若有阳性结果出现，该批次实验结果作废并查明原因。6.2 与样品接触过的容器和废弃物应经 121 高压灭菌 20 min。DB12/T 9562020 6 A A 附 录 A（资料性附录）97 孔定量盘法 MPN 表（MPN/100 mL）表A.1 97 孔定量盘法 MPN 表 DB12/T 9562020 7 DB12/T 9562020 8 DB12/T 9562020 9 DB12/T 9562020 10 DB12/T 9562020 11 DB12/T 9562020 12 DB12/T 9562020 13 _