1、ICS 65.120 B 25 DB12 天津市地方标准 DB12/T 9462020 饲料中氨基酸的测定 离子交换色谱法 Determination of amino acids in feeds-Ion exchange chromatography 2020-06-29 发布 2020-08-01 实施 天津市市场监督管理委员会 发 布 DB12/T 9462020 I 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：杨鸿雁、梁世岳、李玉鹏、陈龙宾、范寰、乔家运。DB12/T 94
2、62020 1 饲料中氨基酸的测定 离子交换色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中氨基酸的离子交换色谱法测定方法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品的采集与制备、测定步骤和结果计算。本标准适用于饲料原料、配合饲料及浓缩饲料中氨基酸含量的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样
3、的制备 3 原理 3.1 常规酸水解法 饲料中的蛋白质在盐酸的作用下，水解成单一氨基酸，经离子交换色谱法分离并以茚三酮柱后衍生测定。水解中，色氨酸全部被破坏，不能测量，胱氨酸和蛋氨酸部分氧化，不能测准。3.2 氧化酸解法 将饲料蛋白中的含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）用过甲酸氧化，使之转变为对酸稳定的氧化物，再通过酸水解法释放出来，经离子交换色谱法分离并以茚三酮柱后衍生测定。3.3 碱水解法 饲料中的蛋白质在碱的作用下，水解出色氨酸，经离子交换色谱法分离并以茚三酮柱后衍生测定。4 试剂和材料 4.1 本标准所用试剂和水，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和 GB/T 6682 中规定的一级水；所
4、述溶液如未指明溶剂均系水溶液。试验中所需溶液、制剂及制品，在没有注明其它要求时均按 GB/T 603的规定制备。4.2 盐酸：优级纯。4.3 盐酸溶液（6 mol/L）：量取盐酸 500 mL，用水稀释至 1000 mL，混匀。4.4 茚三酮溶液：按仪器说明书配制或购买。4.5 pH 系列缓冲液、再生液：按仪器说明书配制或购买。DB12/T 9462020 2 4.6 甲酸：浓度为 88%。4.7 过甲酸溶液：将 30%过氧化氢与甲酸按体积比 1:9 混合，室温放置 1 h，置冰水浴中冷却 30 min,临用前配制。4.8 盐酸溶液（7.2 mol/L）：取盐酸 600 mL，用水稀释至 10
5、00 mL，混匀。4.9 氢氧化锂溶液（4 mol/L）：称取一水合氢氧化锂 167.8 g，用水溶解并稀释至 1000 mL，混匀。4.10 柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸三钠 14.71 g、氯化钠 2.92 g 和柠檬酸 10.50 g，溶于 500 mL 水中，加入硫二甘醇 5 mL 和辛酸 0.1 mL，定容至 1000 mL。4.11 氢溴酸（48%）：分析纯。4.12 高纯氮气：纯度为 99.999%。4.13 氨基酸混合标准储备液：含 L-天门冬氨酸、L-苏氨酸等 17 种常规水解分析用氨基酸，各组分浓度均为 2.50 mol/mL。4.14 磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准储 备液：准确
6、称取磺基丙氨酸（纯度99.0%）105.7 mg 和蛋氨酸砜（纯度99.0%）113.3 mg，用水溶解并定容至 250 mL,浓度均为 2.50 mol/mL，28保存，有效期 1 年。4.15 色氨酸标准储备液：准确称取色氨酸标准品（色谱纯）127.5 mg，加少许水和数滴 0.1 mol/L氢氧化钠溶液使之溶解，用水定容至 250 ml，浓度为 2.50 mol/mL，28保存，有效期 1 年。4.16 混合氨基酸标准工作液：准确吸取氨基酸混合标准储备液、磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准储备液和色氨酸标准储备液各 1 mL，置于 25 mL 容量瓶，用柠檬酸钠缓冲液定容，混匀，各氨基酸组分浓度均
7、为 100 nmol/mL，28保存，有效期 3 个月。5 仪器设备 5.1 样品粉碎机。5.2 样品筛 孔径 0.18 mm。5.3 分析天平 感量 0.1 mg。5.4 恒温鼓风干燥箱。5.5 氮吹仪。5.6 旋涡混合仪。5.7 氨基酸分析仪 具有离子交换柱、茚三酮柱后衍生装置及 570 nm 和 440 nm 光度检测器。6 样品的采集与制备 按GB/T 14699.1采集样品；按GB/T 20195制备样品，要求样品粉碎至过0.18 mm 孔径（80目）样品筛，充分混合均匀后装入密封袋中备用。7 测定步骤 7.1 样品的水解 7.1.1 常规酸水解法 称取试样30 mg70 mg（约含
8、蛋白质5 mg20 mg，精确至0.1 mg）于25 mL水解管中，准确加入10 mL盐酸溶液，充氮气约1 min后拧紧瓶盖，将水解管放入1101恒温干燥箱，水解22 h24 h。冷却至室温，混匀。DB12/T 9462020 3 7.1.2 氧化酸解法 称取试样50 mg100 mg（约含蛋白质7.5 mg25 mg，精确至0.1 mg）于25 mL水解管中，冰水浴冷却30 min后，加入已冷却的过甲酸溶液2 mL，待样品湿润（勿摇），拧紧瓶盖，连同冰浴一起置于04冰箱中，反应16 h，加入0.3 mL氢溴酸，振摇后放回冰浴静置30 min，取出放至室温后，加入10 mL盐酸溶液，充氮气约1
9、 min后拧紧瓶盖，将水解管放入1101恒温干燥箱，水解22 h24 h。冷却至室温，用水将内容物转移到25 mL容量瓶，定容，混匀。7.1.3 碱水解法 称取试样50 mg100 mg（约含蛋白质7.5 mg25 mg，精确至0.1 mg）于10 mL聚四氟乙烯水解管中，加入1.5 mL氢氧化锂溶液，充氮气约1 min后拧紧瓶盖，放入1101恒温干燥箱，水解20 h后，冷却至室温，用水将内容物转移到25 mL容量瓶中，用盐酸溶液中和至pH值为67，定容，混匀。注：以上三种方法依所要测定的氨基酸种类选用。7.2 上机水解液的制备 将上述水解液过滤，取0.5 mL滤液于小试管中，置于氮吹仪，65
10、吹干，必要时加少许水重复蒸干2次3次。准确加入2 mL5 mL柠檬酸钠缓冲液，旋涡混合仪混匀，用0.22 m水系过滤器过滤到上机瓶中，待测。7.3 测定 按照仪器使用说明书放置茚三酮溶液与pH系列缓冲液、再生液，设置仪器色谱条件，将混合氨基酸标准工作液与处理好的样品水解液一同上机测定，仪器自动将试样的各氨基酸色谱峰面积与相应的标准品峰面积对比，计算分析，得出各氨基酸的含量，见图1。图1 混合氨基酸标准工作液色谱图 8 结果计算 DB12/T 9462020 4 8.1 计算方法 氨基酸含量计算见式（1）。W（%）=.(1)式中：W某氨基酸的含量，%；A每毫升上机水解液氨基酸的含量，ng；D稀释倍数；M试样质量，mg。8.2 允许差 对于酸解测定的氨基酸，当含量小于或等于0.5%时，两平行样测定值相对偏差不大于5%；含量大于 0.5%时，相对偏差不大于4%。对于色氨酸，当含量小于0.2%时，两平行样测定值之差不大于0.03%；含量大于或等于0.2%时，相对偏差不大于5%。_