1、ICS 67.120.30 B 51 DB13 河北省地方标准 DB13/T 27462018 西伯利亚鲟种质鉴定规范 2018-07-16 发布 2018-08-16 实施 河北省质量技术监督局 发 布 DB13/T 27462018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北省农业厅提出。本标准起草单位：河北省海洋与水产科学研究院、河北农业大学海洋学院、保定市水产技术推广站、曲阳县满鑫鲟鱼繁育养殖有限公司。本标准主要起草人：肖国华、宫春光、高晓田、任雪莲、张建修、徐荣郅、王东辉、胡志山、殷蕊、张耀红。DB13/T 27462018 1 西伯利亚鲟种质鉴定规
2、范 1 范围 本标准规定了西伯利亚鲟（Acipenser baerii）的学名与分类、生物学特征、生长与繁殖、遗传学特性、检测方法与检验规则。本标准适用于西伯利亚鲟的种质检测与鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.1 养殖鱼类种质检验 第1部分：检验规则 GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分：抽样方法 GB/T 18654.3 养殖鱼类种质检验 第3部分：性状测定 GB/T 18654.4 养殖鱼类种质检验 第4部
3、分：年龄与生长的测定 GB/T 18654.6 养殖鱼类种质检验 第6部分：繁殖性能的测定 GB/T 18654.13 养殖鱼类种质检验 第13部分：同工酶电泳分析 GB/T 18654.14 养殖鱼类种质检验 第14部分：DNA含量的测定 GB/T 18654.15 养殖鱼类种质检验 第15部分：RAPD分析 3 学名与分类 3.1 学名 西伯利亚鲟（Acipenser baerii）。3.2 分类地位 属鲟形目（Acipenseriformes）,鲟科（Acipenseridae）,鲟属(Acipenser)。4 生物学特征 4.1 外部形态 鱼体修长，呈纺锤形，横切呈五角形，向尾部延伸变
4、细，吻长尖，口腹位，口裂较小，一字形。歪形尾，鳃盖骨愈合为一,鳃盖膜彼此不相连而与颊部相连。体裸露无鳞具5列骨板，1列背骨板，2列侧骨板，2列腹骨板；第一背骨板不是最大的骨板,身体最高点不在第一骨板处；侧骨板通常与躯干部颜色相似；腹骨板与背骨板间具有许多星状薄骨板或微小颗粒，吻须4根，介于吻突与口裂之间，稍靠近口裂。鳃耙有结节，一般为3个。鱼体背部呈淡灰黑色或暗褐色，两侧较淡，腹部为白色。西伯利亚鲟的外部形态见图1。DB13/T 27462018 2 图1 西伯利亚鲟外形 4.2 可数性状 背鳍鳍式：D.3056。臀鳍鳍式：A.1733。背骨板数：1020。侧骨板数：3756，通常为4247。
5、腹骨板数：716。第一鳃弓（左）外侧鳃耙数：2049，通常为2732。4.3 可量性状比例 西伯利亚鲟可量性状比例见表1。表1 西伯利亚鲟的可量性状比例（平均值标准差）项 目 指 标 8 月龄鱼 3 龄鱼 10 龄鱼 全长/体长 a 1.310.04 1.250.06 1.280.04 体长/体高 6.650.64 6.150.04 5.530.51 体长/头长 3.690.25 3.790.34 4.090.28 头长/吻长 1.740.17 2.090.18 2.090.17 头长/眼径 22.131.97 23.526.72 23.704.21 头长/眼间距 3.590.48 3.170
6、.39 3.290.30 头长/尾柄高 8.471.23 6.391.51 5.751.01 尾柄长/尾柄高 2.840.64 2.280.57 2.50.52 a 采用从吻端到尾鳍基部的长度 5 生长与繁殖 5.1 生长 在人工养殖条件下，不同年龄组的西伯利亚鲟鱼体长和体重范围见表2。DB13/T 27462018 3 表2 西伯利亚鲟各年龄组体长和体重范围 项目 指标 1 龄鱼 2 龄鱼 3 龄鱼 4 龄鱼 5 龄鱼 体长（cm）4050 5070 7085 90100 100120 体重（g）400600 15002000 30004000 50007000 70009000 a 依据北
7、方地区流水养殖模式，年龄以周年计 5.2 繁殖 性成熟年龄：自然条件下雌鱼为19龄20龄，雄鱼为17龄18龄；人工养殖条件下雌鱼为7龄以上，雄鱼为5龄以上。繁殖周期：野生状态下为2年以上；人工养殖条件下为1年以上。怀卵量占体重的10%30%。6 遗传学特征 6.1 西伯利亚鲟 DNA 含量 西伯利亚鲟细胞中DNA含量为N=8.980.115 pg。6.2 生化遗传学特征 西伯利亚鲟肝脏酯酶（EST）同工酶有6条酶带，电泳图及酶带电泳模式图见图2。1-电泳图谱，2-模式图 图2 西伯利亚鲟肝脏酯酶电泳图谱及模式图 6.3 分子遗传学标记 6.3.1 西伯利亚鲟特异性 RAPD 遗传图谱的建立及特
8、征标记 RAPD引物（CCGCCCAAAC）PCR扩增的结果如图3所示。DB13/T 27462018 4 1-西伯利亚鲟池，2、3-西伯利亚鲟个体，4-marker 图3 RAPD 引物的扩增产物 6.3.2 西伯利亚鲟微卫星 DNA 分子标记的建立 采用14对微卫星引物进行基因型鉴定，西伯利亚鲟在这14对引物的等位基因长度范围见表3。基因型数据分析结果见图4。表3 14 个微卫星引物序列及其在西伯利亚鲟的等位基因长度范围 位点名称 引物序列 (5-3)等位基因长度范围(bp)Atr-1101 F：TATCCCCTCCACTGGAAAT R：GTTAAACATCCCTGCCTTCA 1432
9、03 Atr-105 F:CGATTTGATTGGCTCTTGTA R:TGCAAATAAATTGGAGCTGA 157173 Atr-107 F:GGCAGGATTACATCTCCTGA R:TTACTAACTGCTAGATAATACCTCTCT 188242 Atr-109 F:ACCCGAGCTGTCACATTACT R:AAAATAACGCGAATTCCTGA 162300 Atr-114 F:GCAATTCGTGTTATGTTCATTT R:TGCATTCAGAGAATAACCGA 201251 Atr-117 F:TGCATGACACAGGACTTACC R:TGCCTCTCAAT
10、AGCAACATC 191259 Abr39 F:ACCCGCAATTATTAGGAC R:CAGGACAAACTCAGACCC 178276 Abr40 F:TCACGCAGTCTCACAAGG R:TTCAATGGCAAACAGCAC 384418 Abr41 F:ACACTATCCCGCCACAAT R:CCACTGAAGCCATCATCT 322410 Afu19 F:CATCTTAGCCGTCTGTGGTAC R:CAGGTCCCTAATACAATGGC 120139 Afu22 F:TCCACAATCCTGAATAATGAC R:GCACCATCTAATACGAAATTG 1402
11、42 Afu39 F:TTCTGAAGTTCACACATTG R:ATGGAGCATATTGGAAGG 119140 Afu54 F:CTCTAGTCTTTGTTGATTACAG R:CAAAGGACTTGAAACTAGG 149221 Afu68 F:TTATTGCATGGTGTAGCTAAAC R:AGCCCAACACAGACAATATC 128250 DB13/T 27462018 5 1、西伯利亚鲟品种池，2、非西比利亚鲟样品。图4 微卫星标记基因型数据分析结果图 7 检测方法 7.1 抽样方法 按GB/T 18654.2执行。7.2 性状检测 按GB/T 18654.3执行。7.3
12、年龄与生长测定 按GB/T 18654.4执行。7.4 繁殖性能测定 按GB/T 18654.6执行。7.5 DNA 含量测定 按GB/T 18654.14执行。7.6 同工酶测定 样品制备、电泳分析按GB/T 18654.13执行。7.7 分子遗传学标记方法 7.7.1 DNA 的提取 DNA的提取按GB/T 18654.15执行。7.7.2 PCR 扩增反应 扩增反应总体积为25 L，其中包括摸板DNA30 ng、10PCR缓冲液（含Mg2+）2.5 L、d NTPS（2.5m Meach）2 L、Taq酶（5 u/L）0.3 L、引物1 p M（RAPD法和微卫星DNA法分别使用各自的引
13、物）。RAPD法反应程序为：95预变性5 min，94 45 s、36 45 s、72 90 s，45cycles，72延伸5 min。DB13/T 27462018 6 微卫星DNA法反应程序为：94变性45 s、退火45 s（各引物退火温度详见表4）、72延伸45 s，40cycles，72再延伸5 min。扩增反应结束后，取5 L产物与1 L上样缓冲液混合点样，在含溴化乙锭的1.4%琼脂糖凝胶中电泳1 h2 h，电压80 v，紫外灯下观察结果并拍照记录。表4 14个微卫星位点重复序列结构和退火温度 位点名称 重复序列结构 退火温度（）Atr-1101(TATC)10 55 Atr-105
14、(GATA)15 50 Atr-107(TAGA)17 57 Atr-109(GA)5(TAGA)20 55 Atr-114(TAGA)23 60 Atr-117(GATA)8 55 Abr 39(TATC)18 58 Abr 40(TCTA)6(TAGA)12 61 Abr 41(TCTA)17 65 Afu19(TTG)5 53 Afu22(TAAA)5(GAA)19 52 Afu39(CAA)14 55 Afu54(GATA)2(GATA)2 55 Afu68(GATA)21 55 7.7.3 结果分析 7.7.3.1 RAPD 法结果分析 向PCR产物中加入上样缓冲液，94解链5 mi
15、n，迅速置于冰中冷却至室温，4保存备用。使用95%酒精把长板擦洗一遍，待酒精挥发后涂1.5 mL亲和溶液；再使用95%酒精把短板也擦洗一遍，待酒精挥发后涂200 L剥离溶液。取6%变性聚丙烯酰胺溶液80 mL，加入60 L四甲基乙二胺，180 L的10%过硫酸铵（现用现配），充分混匀后灌入两块玻璃之间。用鲨鱼齿梳子的背面沿两玻璃板缝隙水平插入胶中约5 mm6 mm。等约1.5 h待凝胶聚合后，拔出梳子，用水将玻璃板表面冲洗干净，擦干后装在电泳槽上。向电泳槽的上下缓冲液槽中加入0.5TBE缓冲液，使缓冲液没过短板。1800 V恒压预电泳20 min。预电泳之后，在每个加样孔中加入5 L解链后样品，1800 V恒压电泳1.5 h2.5 h。电泳结束后，小心分离两块玻璃板，将粘有凝胶的长板浸入染色液中，染色5 min15 min，用蒸馏水漂洗30 s，浸入在显影液中显影至带型清晰，再用蒸馏水漂洗5 min。晾干长板后，拍照记录结果。7.7.3.2 微卫星 DNA 法结果分析 使用普通微卫星引物进行PCR扩增时，基因型判读同上述RAPD法。使用荧光微卫星引物进行PCR扩增时，直接使用基因分析仪进行基因型判读。使用软件STRUCTURE 2.3对基因型数据进行综合分析。8 检验与判定规则 检验规则按GB/T 18654.1执行，各项检测指标均符合第4、5、6条规定则判定为西伯利亚鲟。_