1、ICS 11.220 B 41 备案号：54236-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 25592016 牛新孢子虫病检测方法 LAMP 法 LAMP assay for detection of bovine Neosporaosis 2016-12-09 发布 2017-03-01 实施 吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25592016 I
2、前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：贾立军、柴方红、张守发、梁晚枫。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25592016 1 牛新孢子虫病检测方法 LAMP 法 1 范围 本标准规定了牛新孢子虫病LAMP检测方法的技术要求。本标
3、准适用于牛新孢子虫病病原检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 新孢子虫病 Neosporiasis 由犬新孢子虫(Neospora caninum)引起的多种动物的一种原虫病，该病主要引起母畜的流产、死胎或新生胎儿的运动障碍和神经系统疾病。3.2 环介导等温扩增(LAMP)Loop-mediated isothermal amplification
4、针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下(63左右)保温30 min60 min，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，即而完成的核酸扩增反应。4 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。4.1 常规试剂 4.1.1 100 mg/mL 溶菌酶见附录 A.1。4.1.2 10 mg/mL 蛋白酶 K 见附录 A.2。4.1.3 10%十二烷基磺酸钠见附录 A.3。4.1.4 5%十六烷基三甲基溴化铵见附录 A.4。4.1.5 TE（pH8.0）见附录 A.5。4.1.6 50TAE 缓冲液见附录 A.6
5、。4.1.7 加样缓冲液见附录 A.7。4.1.8 1.5%琼脂糖凝胶的制备见附录 A.8。4.2 分子生物学试剂 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25592016 2 Bst DNA Polymerase、SYBR Green、限制性内切酶Taq、组织DNA提取试剂盒、血液DNA提取试剂盒、溴化乙锭、DNA Marker分子量标准等。使用或稀释时均参照试剂说明书进行。4.3 引物 表1 LAMP 特异性引物序列及浓度 引物 引物序列 引物浓度 F3 ATGCTTGTGTGGTGAGGC 0.2 mo
6、l/L B3 CAAGTGCCACCCACTGATC 0.2 mol/L FIP CGCTGACCGATCGGTTAACTGATTGCCAAACTCAGTGCGT 1.6 mol/L BIP TTAGCAGTTGGGGTGTCGGGTACCCTGTTTCGGGAGACA 1.6 mol/L 4.4 标准阳性、阴性对照 4.4.1 标准阳性样品为犬新孢子虫基因组 DNA提取物，DNA 浓度为 10 mg30 mg。制备方法见附录 B。4.4.2 标准阴性样品健康牛组织 DNA 提取物，DNA 浓度为 10 mg30 mg。5 仪器设备 5.1 低温高速离心机（12 000 g 以上）。5.2 恒
7、温水浴锅（室温100）5.3 分析天平（感量 0.1 mg）5.4 电泳槽（水平电泳槽）5.5 电泳仪（电压 1300 V；电流 1400 mA）5.6 凝胶成像系统（带紫外灯）5.7 微量加样器（单道 2 L、10 L、20 L、100 L、200 L、1000 L）5.8 其它分子生物学实验设备（振荡器、小型离心机等）6 试验步骤 6.1 样品采集 无菌采集流产胎牛脑、肝、脾、肺等组织样品，或牛的血液样品，置灭菌1.5 mL塑料离心管中，进行样品处理；或冷冻保存，备用。6.2 样品处理 待检样品组织DNA或血液DNA的提取，按试剂盒说明书进行。6.3 LAMP 反应 LAMP反应体系：总体
8、系25 L。同时设置阳性对照、阴性对照和水对照。LAMP反应条件：63反应60 min，80 2 min终止反应。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25592016 3 表2 LAMP 反应体系 加样物 浓度 体积 DNA 模板 1030 mg 2 L MgSO4 6.0 mmol/L 3 L dNTP 1.4 mmol/L 3.5 L F3 0.2 mol/L 1 L B3 0.2 mol/L 1 L FIP 1.6 mol/L 1 L BIP 1.6 mol/L 1 L Bst DNA Polyme
9、rase Buffer 10 2.5 L Bst DNA Polymerase 8 U/L 1 L ddH2O 9 L 总体系 25 L 6.4 结果判定 6.4.1 眼观判定 将样品反应物加入1000 SYBR Green I 2 L，室温放置10 min，置于凝胶成像仪的紫外灯下观察。阳性对照样品应呈现绿色荧光，阴性对照与水对照样品应呈现棕色、无荧光。在对照成立的前提下，样品呈现绿色荧光判为阳性，呈现棕色、无荧光判为阴性。具体参考标准见附录C.1。6.4.2 电泳判定 取样品反应物2 L加入到1.5%琼脂凝胶板的样品孔中，并设置标准阳性、阴性和标准分子量DNA Marker。将凝胶在150
10、 V恒定电压下电泳30 min后，置于凝胶成像仪观察。阳性样品应呈现特征性梯状条带，阴性与水对照样品无条带。具体参考标准见附录C.2。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25592016 4 A A 附 录 A（规范性附录）环介导等温扩增（LAMP）常用溶液配制 A.1 100 mg/mL溶菌酶 表A.1 100 mg/mL 溶菌酶 溶菌酶 100 mg 灭菌双蒸水 定容至 1 mL A.2 10 mg/mL蛋白酶K 表A.2 10 mg/mL 蛋白酶 K 蛋白酶 K 10 mg 灭菌双蒸水 定容至 1
11、mL A.3 10%十二烷基磺酸钠（SDS）表A.3 10%十二烷基磺酸钠（SDS）十二烷基磺酸钠（SDS）10 g 灭菌双蒸水 定容至 100 mL 注：分装，灭菌，室温保存。A.4 5%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）表A.4 5%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）0.5 g 灭菌双蒸水 定容至 10 mL A.5 TE（pH 8.0）10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)与1 mmol/L的EDTA（pH 8.0）等体积混合，高压灭菌。A.6 50TAE缓冲液 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印
12、本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25592016 5 A.6.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）表A.5 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）乙二铵四乙酸二钠 18.6 g 灭菌双蒸水 80 mL 注：用氢氧化钠溶液调pH至8.0，灭菌双蒸水定容至100 mL。A.6.2 TAE缓冲液（50）配制 表A.6 TAE 缓冲液（50）配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris）24.2 g 冰乙酸 5.71 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）10 mL 注：加去离子水定容至 100 mL，室温保存备用，使用时稀释
13、50为工作液。A.7 加样缓冲液 表A.7 加样缓冲液 溴酚蓝 10 mg 甘油 2.5 mL 0.5 mol/L pH 6.8 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液 定容至 10 mL A.8 1.5%琼脂糖凝胶的制备 表A.8 1.5%琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖 1.5 g 1TAE 缓冲液 定容至 100 mL 将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温冷却到50 左右，加入10 mg/mL的溴化乙锭10 L，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，4 备用。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得
14、翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25592016 6 B B 附 录 B（规范性附录）标准阳性对照模板 DNA 制备 B.1 取体外培养收集的犬新孢子虫悬液 150 L加入 1.5 mL离心管中，加入溶菌酶（100 mg/mL）15L，充分混匀，37下 1 h。B.2 依次加入蛋白酶K(10 mg/ml)9 L、10%SDS 105 L、5 mol/L NaCl 150 L、5%CTAB 240 L，充分混匀后，65下 10 min。B.3 加入等体积Tris-饱和酚和氯仿反复抽提两次，氯仿洗涤一次。B.4 取上层于另一 1.5 mL离心管中，加入等体积无水乙醇和 1/10 体积
15、醋酸钠沉淀 30 min。B.5 4下 12 000 r/min离心 15 min，弃上清。B.6 将 70%乙醇 100 L沿管壁徐徐加入，4下 12 000 r/min离心 1 min，吸弃上清，干燥。B.7 用 20 L TE溶解DNA，取一部分测定OD260 和OD280，计算所提的DNA浓度和纯度，其余基因组总 DNA于-20保存、备用。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 25592016 1 C C 附 录 C（规范性附录）LAMP 扩增结果判定标准 C.1 眼观判定LAMP扩增标准：1 2 图C.1 LAMP 扩增后加入 SYBR Green I 紫外灯下眼观结果 注1：标准阳性对照 注2：标准阴性对照 C.2 电泳判定LAMP扩增标准：图C.2 LAMP 扩增电泳结果 M:DL 2000 DNA Marker；注1：标准阳性对照 注2：标准阴性对照 _ 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印