1、 DB53/T 8772018 甘蔗锈病病原菌分子检测技术规程 2018-07-01 发布 2018-10-01 实施ICS 65.020 B 15 中华人民共和国国家市场监督 管理总局备案号：59625-2018 云南省地方标准 云南省质量技术监督局 发 布 DB53/T 8772018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。本标准由云南省农业标准化技术委员会(YNTC07)归口。本标准起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。本标准主要起草人：王晓燕、李文凤、黄应昆、张荣跃、单红丽、仓晓燕、
2、罗志明、尹炯。DB53/T 8772018 1 甘蔗锈病病原菌分子检测技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗锈病病原菌PCR检测方法的样品采集、设备和器具、试剂、对照设置、操作程序以及结果判定等。本标准适用于甘蔗锈病病原菌的分子检测。2 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 甘蔗锈病 是指由黑顶柄锈菌Puccinia melanocephala H.Sydow&P.Sydow引起甘蔗褐锈病症状的真菌病害，和由屈恩柄锈菌Puccina kuehnii(Kruger)Butler引起甘蔗橙锈病的真菌病害。甘蔗锈病症状及其病原菌形态特征参见附录A。3 样品采集 3.1 采集时间 于 8 月1
3、0 月采集疑似甘蔗褐锈病和甘蔗橙锈病的病叶。3.2 采集部位 甘蔗叶片组织。3.3 采集方法 宜戴一次性手套采集，且每采一个样品换一次手套，过程中应避免样品交叉污染。3.4 样品保存 样品放入密封袋中，于-20保存备用。DB53/T 8772018 2 4 PCR 检测 4.1 设备和器具 4.1.1 设备 设备包括PCR扩增仪、凝胶成像仪、台式离心机、涡旋混匀器、恒温水浴锅、电泳仪、电子天平（感量 0.01 g0.0001 g）、电泳槽、微波炉、-20冰箱、可调微量移液器等。4.1.2 器具 移液枪头、离心管、PCR管等。4.1.3 器具灭菌 所有器具使用前需经高压蒸汽121灭菌30 min
4、。4.2 试剂 4.2.1 基本要求 所用试剂均为分析纯，水为灭菌去离子水。4.2.2 PCR 试剂 PCR试剂包括：a)2EasyTaq PCR SuperMix（含染料）。b)检测黑顶柄锈菌引物（上游引物PM-F：5-AATTGTGGCTCGAACCATCTTC-3、下游引物PM-R：5-TTGCTACTTTCCTTGATGCTC-3）。c)检测屈恩柄锈菌引物（上游引物PK-F：5-AAGAGTGCACTTAATTGTGGCTC-3、下游引物PK-R：5-CAGGTAACACCTTCCTTGATGTG-3）。4.2.3 TBE 电泳缓冲液 4.2.3.1 10TBE 存储液 取108 g
5、Tris、55 g硼酸和7.44 g Na2EDTA2H2O，加入约800 mL去离子水充分搅拌溶解，定容至1000 mL，室温保存。4.2.3.2 0.5TBE 工作液 用去离子水将存储液稀释20倍，即为工作液。4.2.4 扩增产物检测试剂 琼脂糖、Goldenview核酸染料。4.2.5 对照设置 按以下进行对照设置：a)以确认为甘蔗褐锈病和甘蔗橙锈病的样品作为阳性对照。b)以健康甘蔗叶片样品作为阴性对照。c)以灭菌去离子水作为空白对照。DB53/T 8772018 3 4.3 操作步骤 4.3.1 总 DNA 的提取 总 DNA 按以下方法提取：a)取 0.1 g 疑似病叶组织，用液氮冷
6、冻研磨至粉状，用植物基因组 DNA 提取试剂盒，提取疑似病叶总 DNA，具体方法步骤按照提取试剂盒说明书操作。b)提取后用蛋白/核酸分析仪鉴定 DNA 质量，当 A260/A280比值为 1.82.0 时，适合于 PCR 扩增。4.3.2 PCR 扩增 按以下方法进行PCR扩增：a)在200 L PCR管中按序加入灭菌去离子水10 L、2EasyTaq PCR SuperMix 12.5 L、DNA模板0.5 L、上游引物1 L（20 g/L）、下游引物1 L（20 g/L）,充分混匀后快速离心10 s后放进PCR仪。b)扩增程序为：94预变性5 min；94变性30 s，56退火1 min，
7、72延伸30 s，35个循环；72延伸7 min。c)每个样品进行3次重复扩增检测。4.3.3 琼脂糖凝胶电泳 按以下方法进行琼脂糖凝胶电泳：a)用琼脂糖加入0.5%的TBE缓冲液中配制成1.0%（W/V）的溶液，加热至琼脂糖完全熔化。b)待凝胶冷却至5060时，加入0.005%的Goldenview核酸染料混匀，将其倒入制胶板上，插上梳板。c)充分冷却后，轻轻拔去梳板，放入装有0.5TBE缓冲液的电泳槽中。d)每个样品取10 L PCR产物依次加入点样孔里，在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，140 V电压下电泳20 min，把胶板取出后用凝胶成像仪观察、拍照。4.3.4 结果判定 阳性
8、对照有条带，阴性对照和空白对照无条带时，检测结果有效。当检测结果有效时，依据表1进行结果判定。表1 甘蔗锈病病原菌分子检测结果判定标准 目的条带大小 样品 阳性对照 阴性对照 空白对照 结果判定 480 bp 有 有 无 无 含黑顶柄锈菌 527bp 有 有 无 无 含屈恩柄锈菌 DB53/T 8772018 4 附 录 A(资料性附录)甘蔗锈病症状及甘蔗锈病病原菌形态特征 A1 甘蔗锈病症状特征见图 A.1 a.褐锈病褐锈病：病斑分散，b.橙锈病橙锈病：病斑聚集呈簇，长约 长约1030 mm，宽13 mm，3 mm8 mm，宽 1 mm2 mm，夏孢子堆呈红褐色。夏孢子堆呈橘黄色。图A.1
9、甘蔗锈病症状图A.1 甘蔗锈病症状 A2 病原菌形态特征见图A.2 a.黑顶柄锈菌黑顶柄锈菌:夏孢子球形或倒卵形，褐色 b.屈恩柄锈菌：屈恩柄锈菌：夏孢子梨形或倒卵形，金 至深褐色，表面密布小刺，壁四周均匀加厚 黄色至淡栗褐色，表面有刺，壁顶端显著加，大小为（2040）m （1325）m，厚10 m或更多，大小为（2550）m 芽孔多4个；侧丝较多，无色，匙形。（1635）m，具芽孔45个，无侧丝。图A.2 甘蔗锈病病原菌形态特征 图A.2 甘蔗锈病病原菌形态特征 _ DB53/T 8772018 版权专有 不得翻印 侵权必究 举报电话：（0871）63215571（0871）63215571