1、ICS65.020CCS B 1553云南省地方标准DB53/T 10822022高粱花叶病毒 RT-PCR 检测技术规程2022-05-20 发布2022-08-20 实施云南省市场监督管理局发 布DB53/T 10822022I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC 07）归口。本文件起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。本文件主要起草人：李婕、黄应昆、单红丽、王晓燕、张荣
2、跃、仓晓燕、王长秘、尹炯、罗志明。DB53/T 108220221高粱花叶病毒 RT-PCR 检测技术规程1范围本文件规定了高粱花叶病毒RT-PCR检测方法中涉及的仪器与耗材、试剂、检测样品的取样及对照设置、检测方法和结果判定等。本文件适用于高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）侵染的植物样品的RT-PCR检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1高粱花叶病毒 Sorghum mosaic virus高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯
3、Y病毒属（Potyvirus），是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一，英文名称为Sorghum mosaic virus，缩写为SrMV，参见附录A。3.2RT-PCR反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）的简称，是一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，以获得RNA特定片段。4仪器与耗材4.1仪器主要仪器包含电子天平、恒温水浴锅、高速台式冷冻离心机、蛋白/核酸分析仪、PCR扩增仪、涡旋混匀器、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、可调微量移液器、研钵等。4.2耗
4、材无核酸酶（Nuclease-free）的1.5mL和2.0 mL离心管及0.2 mL PCR管等。5试剂5.1常规试剂液氮、焦碳酸二乙酯（DEPC）灭菌水或者RNase-free水、植物总RNA提取试剂盒、三氯甲烷、70%乙醇、异丙醇、无水乙醇等。DB53/T 1082202225.2RT-PCR 试剂Oligo(dT)18引物（0.5 g/L），RT-PCR反转录试剂盒，含溴酚蓝染料的2EasyTaq PCR SuperMix聚合酶混合物。5.3引物5.3.1上游引物SrMV-F：5-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3，下游引物SrMV-R：5-TTTCATCTGCATGTGGG
5、CCTC-3（R=A/G，Y=C/T）。5.3.2用无核酸酶的水将上、下游引物分别配制成浓度为 20M 的水溶液。5.3.3目的扩增片段约为 820 bp。5.4电泳缓冲液的配制按以下步骤配制电泳缓冲液：a)称取 242 g 的 Tris，先用 300 mL 的 ddH2O 搅拌溶解后，加 100 mL 0.5 mol/L 的 EDTA 水溶液配制 50TAE 储存液；b)用 ddH2O 将储存液稀释 50倍配制 1TAE 工作液；c)称取 Tris108 g、硼酸 55g、7.44 g 的 Na2EDTA2H2O，加入 40 mL 0.5 mol/L 的 EDTA 水溶液，再用 ddH2O
6、定容至 1 000 mL 配制 10TBE 储存液；d)用 ddH2O 将储存液稀释 20倍配制 0.5TBE 工作液。5.5扩增产物电泳检测试剂1%左右（W/V）琼脂糖，核酸染料。6检测样品的取样及对照设置6.1阳性对照以SrMV侵染的植物样品作为阳性对照。6.2阴性对照以健康植物样品作为阴性对照。6.3空白对照以灭菌ddH2O作为空白对照。6.4取样戴一次性手套采集甘蔗叶片或芽作为待检样品，且每采一个样品跟换一次手套，过程中不应交叉污染。将采的集样品放入自封袋中，编号，冷藏运输到实验室液氮速冻后，于-80 冰箱保存备用。7检测方法7.1总 RNA 提取总RNA提取步骤如下：DB53/T 1
7、08220223a)戴一次性手套称取 0.1g 待测样品置于灭菌研钵中，液氮冷冻，研磨至粉状后放入 1.5 mL 离心管中，并对每支管进行编号；b)用核酸提取试剂盒提取样品总 RNA，按提取试剂使用说明书进行操作；c)提取后用蛋白/核酸分析仪测定 RNA 相对浓度，当 A260/A280 比值为 1.82.0 时，可用于RT-PCR 检测。7.2反转录按以下步骤进行反转录：a)以提取的总 RNA 为模板，在 PCR 管中按序依次加入：Oligo(dT)18引物约 0.5 L、RNA 模板约 2.0 L（约 200 ng）、反转录试剂、灭菌 DEPC 水补足 10L 反转录反应体系，混匀；b)2
8、 000 rpm 快速离心 10 s，放入 PCR 仪合成 cDNA，按 RT-PCR 试剂盒说明书进行操作。7.3PCR 扩增按以下步骤进行PCR扩增：a)以合成的 cDNA 第一链为模板，在 PCR 管中按序依次加入：灭菌 DEPC 水 7.2 L、含溴酚蓝染料的 2EasyTaq PCR SuperMix 聚合酶混合物 10 L、反转录产物（cDNA）2.0 L、0.4 L上游引物 SrMV-F（20 M）、0.4 L 下游引物 SrMV-R（20 M），制成 20 L PCR 反应体系，2 000 rpm 快速离心 10 s 混匀后放进 PCR 仪进行 PCR 扩增；b)94 预变性
9、5 min；c)94 变性 30 s，60 退火 30 s，72 延伸 1 min，35 个循环；d)72 延伸 10 min。7.4琼脂糖凝胶电泳检测按以下步骤进行：a)用 1TAE 或 0.5TBE 缓冲液配制 1.0%左右（W/V）琼脂糖胶，加热至琼脂糖完全熔化；b)待凝胶冷却至 50 60 时，在 100 mL 琼脂糖胶中加入适量的核酸染料，混匀；c)将凝胶倒入置有样品梳的制胶板上；d)待凝胶充分冷却后，拔除样品梳，将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入装有 1TAE 或0.5TBE 电泳缓冲液的水平电泳槽；e)每个样品取 10 L PCR 扩增产物加入样品梳孔，在其中一个样品梳孔中加入
10、6 L DNA 分子量标准（Marker E），130 V 恒定电压下电泳 25 min；f)电泳结束后，把胶板取出用凝胶成像仪观察、拍照。8结果判定阳性对照在820bp左右有条带，阴性对照和空白对照无条带，则检测结果有效。RT-PCR检测结果判定详见表1。DB53/T 108220224表 1RT-PCR 检测结果判定判定条件结果判定RT-PCR产物在820 bp左右有无条带出现（参见附录B）序号空白对照阴性对照阳性对照检测样品1无无有有检测结果有效，被检测甘蔗样品感染高粱花叶病毒2无无有无检测结果有效，被检测甘蔗样品未感染高粱花叶病毒3有/无有/无无有/无检测结果无效，将实验中的所有试剂更
11、换，并重新提取检测样品 RNA，进行 RT-PCR 检测DB53/T 108220225附录A（资料性）高粱花叶病毒A.1高粱花叶病毒高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，英文名称为Sorghum mosaic virus，缩写为SrMV。A.2病原特征A.2.1病毒粒体SrMV病毒粒体呈弯曲线状，无包膜，螺旋对称结构，大小为（750850）nm（1315）nm。A.2.2基因组基因组由一条正单链RNA组成，大小约10 kb，编码一个多聚蛋白，经蛋白酶水解后可产生10 个成熟的蛋白质，从N端
12、到C端依次是P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP，还在P3氨基端编码区发生移码翻译出P3N-PIPO。A.3寄主在自然条件下，SrMV可侵染甘蔗（Saccharum officinarum）、高粱（Sorghum bicolor）、玉米（Zeamays）和细叶芒（Miscanthus sinensis）等禾本科植物。A.4病害症状SrMV侵染为害叶片，花叶症状主要表现在叶片上，尤以新叶基部症状最为明显；病毒可系统侵染，导致整丛蔗株发病，叶色褪绿，产生许多与叶脉平行的黄绿相间不规则条纹，大小长短不一，布满叶片，与正常部分参差间隔成“花叶”；
13、病株生长差、矮化、分蘖少，汁液量减少。A.5传播途径SrMV可通过带毒的无性繁殖材料（种质）、田间病株及种传等方式传播，可通过收获机械、刀具和摩擦接种等方式传播，也可被多种蚜虫（甘蔗棉蚜Ceratovacuna lanigera、黑豆蚜Aphis craccivora、桃蚜Myzus persicae和玉米蚜Rhopalsiphum maidis）以非持久方式传播。A.6分布主要分布于印度、美国、巴西、阿根廷、日本、菲律宾、澳大利亚、中国等国家。DB53/T 108220226附录B（资料性）高粱花叶病毒 RT-PCR 检测电泳图高粱花叶病毒RT-PCR检测电泳图见图B.1。M：Marker E；1-5：感染高粱花叶病毒的甘蔗样品；6-10：未感染高粱花叶病毒的健康甘蔗样品；PC：SrMV阳性对照；NC：阴性对照；CK：空白对照。图 B.1 高粱花叶病毒 RT-PCR 检测电泳图DB53/T 10822022