1、细胞融合 与 单克隆抗体 Cell Fusion and Monoclonal Antibodies 4.1细胞融合 4.2杂种细胞的遗传特性和应用 4.3淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术 4.1细胞融合 4.11聚乙二醇介导的细胞融合 4.12细胞电融合 4.13杂种细胞的筛选 4.1 4.1 细胞融合细胞融合 定义定义：指用自然：指用自然或人工方法、使或人工方法、使两个或更多个不两个或更多个不同的细胞融合成同的细胞融合成一个细胞的过程，一个细胞的过程，又称为体细胞杂又称为体细胞杂交交 4.11 4.11 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）介导的细胞融合）介导的细胞融合 原理：PEG带有大量的
2、负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH,高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。影响因素：影响因素：分子量：分子量：40040060006000（通常：（通常：1000100040004000）浓度：浓度：202060%60%（通常：（通常：303050%50%）时间：时间：悬浮法悬浮法 1 12 min2 min 离心法离心法 5 58 min8 min pHpH：偏碱为宜（偏碱为宜（pH7.4pH7.48.08.
3、0）其他：其他：二甲亚砜、植物血凝素二甲亚砜、植物血凝素 4.12 4.12 细胞电融合细胞电融合 原理：原理：悬于大小不同的两平行电悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的极间的低导电率溶液中的细胞，在细胞，在1 1100MHz100MHz和和1001001000V/cm1000V/cm的交流电的交流电场中，会向小电极移动，场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电并极化成偶极子，而沿电场方向发生场方向发生双向电泳双向电泳，此，此时再加上适当强度和持续时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产使相邻细胞膜的接触区产生生可逆电降解可逆电降解，
4、从而触发，从而触发细胞融合。细胞融合。双向电泳：在交流电场的作用下（1MHz，150V/cm）细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞会发生相互的紧密接触。可逆电降解：在高频电场的脉冲作用下（50ms，电场强度1.22kV/cm），细胞膜上的离子发生位移，而使电荷分开，细胞质膜产生电势，正、负电荷相互吸引，细胞膜变薄，随细胞势的增加，膜降解穿孔，形成微孔。电场诱发的微孔面积和数目与细胞膜总表面积相对不大时，微孔可以重新封闭。电场示意图 甜菜原生质体电融合过程 1）在高频电流电场下的相互接触。2）脉冲刺激后30s 3)50秒后 4）1.5分钟后 5）6分钟后 6）15分钟后，原生质体融合完
5、成。注意事项 1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。优点：优点：融合率高，达7080，甚至100 融合率（融合组多核细胞的核数对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）100 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞 4.13 4.13 杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选 原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。1）亲本 2）同核体：同源原生质体的融合体 3）异核体：非同源的原生质体的融合体 4）多核体：含有双
6、亲不同比例核物质的融合体 5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体 植物细胞筛选方式 1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。如亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白 色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长 2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。如：亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代 亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而
7、亲本和其它细胞死亡 3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体 亲本2：叶肉细胞原生质体 在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分 4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。动物细胞的筛选方式：1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感 亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨
8、苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。4.2 杂种细胞
9、的遗传特性和应用杂种细胞的遗传特性和应用 4.21杂种细胞在细胞生物学研究杂种细胞在细胞生物学研究 中的应用中的应用 4.23杂种细胞在植物育种中的应用杂种细胞在植物育种中的应用 4.21 4.21 杂种细胞在细胞生物学研究中的应用杂种细胞在细胞生物学研究中的应用 1 1）基因定位基因定位 不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被选择性留下，即体被选择性留下，即染色体分离染色体分离的现象。由此，的现象。由此，可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定可根据表型和与表型特征相
10、对应的基因在特定染色体上。染色体上。例如例如 ：HGPRTHGPRT人细胞与人细胞与TKTK的小鼠细胞融合的小鼠细胞融合后，可用后，可用HATHAT培养基分离得到一种仅含一条人培养基分离得到一种仅含一条人E E组染色体的杂种细胞，具有组染色体的杂种细胞，具有TKTK活性，由此得到活性，由此得到人的人的TKTK基因是在基因是在E E组染色体上的。组染色体上的。2 2）体细胞杂种的致瘤性分析体细胞杂种的致瘤性分析 通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析。细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析。3 3）遗传缺陷的基因互补遗传缺陷的基因互补
11、基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。通过这种基因互补，可以用正常基因来治通过这种基因互补，可以用正常基因来治疗由于基因突变或基因缺失的疾病。疗由于基因突变或基因缺失的疾病。4 4）分化功能表达调控的研究分化功能表达调控的研究 通过细胞融合可将不同分化状态或组通过细胞融合可将不同分化状态或组织类型的细胞构建成为能够存活的种织类型的细胞构建成为能够存活的种内或种间杂种，同时对杂种细胞内的内或种间杂种，同时对杂种细胞内
12、的基因组和胞质观察和分析，了解如何基因组和胞质观察和分析，了解如何通过相互作用而最终导致原先表达的通过相互作用而最终导致原先表达的分化性状熄灭或保留。分化性状熄灭或保留。4.22 4.22 杂种细胞在杂种细胞在植物育种中的应用植物育种中的应用 杂种细胞杂种细胞是一条是一条新的育种途新的育种途径径，可以产生新经济性状的，可以产生新经济性状的良种。良种。科学家已经在禾本科、茄科、科学家已经在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得豆科、十字花科等植物中得到了杂种再生植株。到了杂种再生植株。一些近亲植物、有性不亲和一些近亲植物、有性不亲和的组合，如马铃薯的组合，如马铃薯番茄等番茄等都得到了再生植株。都
13、得到了再生植株。目标：地上和地下部兼用种、目标：地上和地下部兼用种、固氮禾等固氮禾等具有两种不同优势具有两种不同优势性状的新品种性状的新品种。4.3 单克隆抗体单克隆抗体 4.31抗体的结构与功能抗体的结构与功能 4.32单克隆抗体的制备和生产单克隆抗体的制备和生产 4.34单克隆抗体的改造和应用单克隆抗体的改造和应用 4.31 4.31 抗体的结构与功能抗体的结构与功能 抗体抗体是由是由B B细胞受抗细胞受抗原刺激后所分泌的原刺激后所分泌的蛋白质。蛋白质。抗体分子：抗体分子：由四条由四条肽链所组成，两条肽链所组成，两条重链（重链（H H链）两条轻链）两条轻链（链（L L链）。链）。结结 合合
14、 区：区：抗体分抗体分子上有两个抗原结子上有两个抗原结合区合区 可变区（可变区（V V区）区）稳定区（稳定区（C C区）区）人体内的五种抗体 4.32单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibody(monoclonal antibody，简称简称McAb)McAb)：将能够产生抗体的：将能够产生抗体的B B淋巴淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种续分泌成分单
15、一的特异性抗体。这种单一类型单一类型的的只针对某一特定抗原决定只针对某一特定抗原决定簇簇的的抗体分子抗体分子，就是单克隆抗体。，就是单克隆抗体。单抗的制备过程单抗的制备过程 动物免疫与亲本细胞的选动物免疫与亲本细胞的选择择 细胞融合：淋巴细胞杂交细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备瘤的制备 杂交瘤细胞的筛选：有限杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等稀释法等 单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的制备和冻存 单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化 亲本细胞的选择 骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT或TK。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大
16、鼠或小鼠。免疫方法：体内法或体外法。体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。34天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95以上的可以用于融合。体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，34天后，收集被刺激的淋巴细胞。细胞融合 将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心710分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG 0.5ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入510ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置10分钟。HAT培养基筛选杂交瘤细胞 细胞团块分散后，加HAT溶液，稀释至骨髓瘤细胞不超过2105 ml，即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；总量分别为0.2ml和1ml。用HAT选择性培养时每隔23天半量换液，7天后可以选择出杂交瘤细胞。细胞融合的选择