1、ICS 71.100.01分类号:Y40T/GDCDC广东省日化商会团体标准T/GDCDC 010-2019化妆品防腐挑战性测试方法Test method for the preservative challenge of cosmetics2019-12-16 发布2020-01-01 实施广东省日化商会发 布全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/GDCDC 010-2019I前言本标准按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则起草。请注意本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由广东省日化商会提出和归口。本标准起草
2、单位:上海新高姿化妆品有限公司、广州中科检测技术服务有限公司、广州薇美姿实业有限公司、广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、广东雅丽洁精细化工有限公司、广东博然堂生物科技有限公司、广东嘉丹婷日用品有限公司、广州市娇兰化妆品有限公司、广东芭薇生物科技股份有限公司、广东润洁日化有限公司、广东迪美生物技术有限公司、南京华狮新材料有限公司、拉芳家化股份有限公司、广东省日化商会。本标准主要起草人:李雪竹、唐嘉雯、钟瑜、陈敏珊、孙廷丽、郑木创、张梅、王耀、曾小云、张娇、张忠伟、刘永龙、任传鹏、周生、刘丽红、卓琦。本标准于2019年12月首次发布。全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/GDC
3、DC 010-20191化妆品防腐挑战性测试方法1范围本标准规定了化妆品的防腐效果测试方法，包括术语和定义、仪器及设备、培养基和试剂、生物菌株、实验步骤和结果计数及报告方法。本标准适用于亲水性的膏、霜、乳、水剂等常见化妆品的防腐效果测试。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1防腐采用化学或物理方法预防或抑制产品内微生物生长的过程。2.2防腐挑战性测试在产品中接入若干种类，一定数量的微生物并定期检测样品中微生物的数量，根据数量的变化来评价其防腐效果。3仪器及设备测试所需仪器及设备如下：a)生物安全柜；b)高压蒸汽灭菌锅；c)冰箱：2-8；d)培养箱：361、282；e)恒温水浴锅；f)振
4、荡器；g)天平：精确至 0.01g；h)pH 计；i)移液器：容量 1mL、5mL 和 10mL；j)灭菌试管：15150mm；k)灭菌培养皿：直径 90mm；l)锥形瓶：容量 250mL；m)玻璃珠；n)玻璃棒；o)均质器；全国团体标准信息平台T/GDCDC 010-20192p)离心机。4培养基和试剂4.1卵磷脂-吐温 80 营养琼脂培养基4.1.1成分蛋白胨20g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g卵磷脂1.0g吐温807.0g蒸馏水1000mL4.1.2制法先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温 80，将其他成分加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温 80，混
5、匀，用 1mol/L 氢氧化钠溶液或 1mol/L 盐酸溶液调节 pH 值至 7.1-7.4，分装，于 121高压灭菌 20 分钟。4.2沙氏琼脂培养基4.2.1成分蛋白胨10.0g葡萄糖40.0g琼脂15.0g氯霉素0.1g蒸馏水1000mL4.2.2制法取上述成分混合，溶解，分装，于115高压灭菌15分钟。4.3卵磷脂-吐温 80 沙氏琼脂培养基4.3.1成分蛋白胨10.0g葡萄糖40.0g琼脂15.0g氯霉素0.1g卵磷脂1.0g吐温807.0g蒸馏水1000mL4.3.2制法全国团体标准信息平台T/GDCDC 010-20193取卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80；取除卵磷
6、脂和吐温80外其他成分加到剩余的蒸馏水中，溶解，再加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，分装，于115高压灭菌15分钟。4.4营养琼脂4.4.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏粉3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mL4.4.2制法取上述成分混合，溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.30.2，分装，于121高压灭菌15分钟。4.5生理盐水称取氯化钠8.5g，蒸馏水加至1000mL，溶解，分装，于121高压灭菌20分钟。4.60.5%氯化三苯四氮唑（TTC）称取氯化三苯四氮唑粉末0.5g，加100mL蒸馏水溶解，过滤除菌或于115高压灭菌20分钟，装于棕色
7、试剂瓶，置4冰箱备用。5生物菌株菌株代数均不超过5代，可根据需求增加其他菌株作为实验菌株。可以使用加入世界菌种保藏联合会的菌种保藏机构提供的、与下述菌种等效的试验菌。5.1细菌金黄色葡萄球菌ATCC6538，大肠杆菌ATCC8739，铜绿假单胞菌ATCC9027。5.2真菌白色假丝酵母ATCC10231，巴西曲霉ATCC16404。6实验步骤6.1样品的背景微生物检查6.1.1从不少于 2 个包装单位的产品中共取 10g 或 10mL，加入到装有玻璃珠的 90mL 灭菌生理盐水锥形瓶中，振荡 20 秒，或加入到装有 90mL 灭菌生理盐水的灭菌均质袋中，使用均质器拍打均质 1-2 分钟，混合后
8、，制成 1:10 稀释液。6.1.2吸取稀释液 4mL，分别注入到四个灭菌平皿内，每皿 1mL。将 45-50卵磷脂-吐温 80 营养琼脂培养基（每 100mL 卵磷脂-吐温 80 营养琼脂中加入 1mL 0.5%TTC 溶液）倾注到其中两个平皿内，另外两个平皿中倾注卵磷脂-吐温 80 沙氏琼脂培养基，每皿约 15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充全国团体标准信息平台T/GDCDC 010-20194分混匀，待琼脂凝固后翻转平皿。6.1.3细菌培养条件：361，48 小时2 小时，然后做菌落计数；真菌培养条件：282，5天，并于第 3 天起逐日1)观察计数，以菌落未蔓延生长的最大天数结果报告
9、。6.22)菌液制备6.2.1混合细菌悬液制备6.2.1.1将待测细菌分别接种到营养琼脂斜面上，于 361培养 18 小时-24 小时。6.2.1.2将 5mL-10mL 的生理盐水加入斜面试管内，反复吹吸洗下菌苔。6.2.1.3分别用移液器将每种菌悬液移至相应的无菌试管中，振荡 20 秒，混匀后，稀释至实验所需浓度 1108 CFU/mL-9108CFU/mL。6.2.1.4将每种细菌菌液稀释液按等体积混合，菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用，若保存在 2-8，可在 24 小时内使用。6.2.1.5取上述菌液1mL加入到9mL生理盐水试管中充分混匀，制成1:10稀释液，以此类推制
10、成1:100，1:1000 等适宜的稀释倍数。取 2-3 个适宜浓度稀释度的稀释液（一般取稀释度为 1:100000，1:1000000和 1:10000000 的稀释液），每个稀释液取 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。6.2.1.6将 45-50营养琼脂倾注到平皿内，每皿约 15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混匀，待琼脂凝固后，倒置于 361培养箱内培养 48 小时2 小时，然后做菌落计数。6.2.2混合真菌悬液制备6.2.2.1将待测真菌分别接种到沙氏琼脂培养基斜面上（或根据菌种培养需求自定），其中，白色假丝酵母于 282培养 24 小时-48 小时，巴西曲霉于 2
11、82培养 5-7 天。6.2.2.2将 5mL-10mL 的生理盐水加入斜面试管内，反复吹吸洗下菌苔。6.2.2.3分别用移液器将每种菌悬液移至相应的无菌试管中，振荡 20 秒，混匀后，制备成实验所需浓1107CFU/mL-9107CFU/mL。6.2.2.4将每种真菌菌液按等体积混合，并使用 100m 细胞过滤器或无菌纱布过滤菌丝体，也可使用离心机离心获取孢子。菌液制备后可保存在 2-8，并在验证过的贮存期内使用。6.2.2.5吸取上述菌液 1mL 加入到 9mL 生理盐水中充分混匀，制成 1:10 稀释液，以此类推制成 1:100，1:1000 等适宜的稀释倍数。取 2-3 个适宜浓度稀释
12、度的稀释液（一般取稀释度为 1:10000，1:100000，1:1000000 的稀释液），每个稀释液取 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。6.2.2.6将 45-50沙氏琼脂培养基（或根据菌种培养需求自定）倾注到平皿内，每皿约 15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混匀，待琼脂凝固后，倒置于 282培养箱内培养 5 天，并于第3 天起逐日观察计数，以菌落未蔓延生长的最大天数结果报告。6.2.3单一细菌悬液制备按6.2.1中6.2.1.1、6.2.1.2、6.2.1.3、6.2.1.5和6.2.1.6步骤操作。6.2.4单一真菌悬液制备按6.2.2中6.2.2.1、6.2.
13、2.2、6.2.2.3、6.2.2.5和6.2.2.6步骤操作。6.3待测样品加菌6.3.1混合菌接种1)当样品中菌落数100 CFU/mL（g）时，方可进行防腐挑战性测试。2)接种方式可根据需求选择混合菌接种或单一菌接种。全国团体标准信息平台T/GDCDC 010-20195在无菌条件下称取样品于两个无菌试剂瓶中，每瓶100g或100mL。在称好的2瓶样品中分别加入1mL的混合细菌菌液和1mL的混合真菌菌液。将菌液和样品充分混合均匀，置于室温（20-25）避光贮存。6.3.2单一菌接种3)在无菌条件下称取样品于无菌试剂瓶中，每瓶100g或100mL。在称好的样品中加入1mL的单一菌液。将菌液
14、和样品充分混合均匀，置于室温（20-25）避光贮存。6.4样品检测6.4.1分别于加菌后第 7、14、21 和 28 天检测化妆品中的菌落数。取样前，充分混匀样品。6.4.2取 10g 或 10mL 样品加到装有玻璃珠及 90mL 灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡 20 秒，或加入到装有 90mL 灭菌生理盐水的灭菌均质袋中，使用均质器拍打均质 1 分钟-2 分钟，混匀后，稀释成 1:10的样品稀释液。6.4.3吸取 1:10 样品稀释液 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。另取 1mL 注入到 9mL 灭菌生理盐水试管中，充分混匀，制成 1:100 检液，并吸取 2mL，分别注入
15、到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成 1:1000，1:10000 等，并吸取各稀释液 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。每个稀释度应换 1 支吸管。6.4.4将 45-50培养基倾注到平皿内，每皿约 15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混匀。含细菌样品采用卵磷脂-吐温 80 营养琼脂培养基培养（每 100mL 卵磷脂-吐温 80 营养琼脂中加入 1mL0.5%TTC 溶液），含真菌样品采用卵磷脂-吐温 80 沙氏琼脂培养基培养，待琼脂凝固后翻转平皿。6.4.5细菌培养条件：361，48 小时2 小时，然后做菌落计数；真菌培养条件：282，5天，并于
16、第 3 天起逐日观察，以菌落未蔓延生长的最大天数结果报告。7结果计数及报告方法7.1菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用5倍-10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。7.2细菌菌落计数及报告方法7.2.1首先选取平均菌落数在 30-300 个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表 1 中例 1)。7.2.2若有两个稀释度，其平均菌落数均在 30-300 个之间，则应求出两菌落总数之比值进决定，若其比值小于或等于 2，应报告其平均数，若大于 2 则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数(见表 1 中例 2及例 3)。7.2.3若所有稀释度的平均菌落数均大于 300 个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表 1 中例 4)。7.2.4若所有稀释度的平均菌落数均小于 30 个，