1、ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 122018 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR 检测方法 Real-Time RT-PCR for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2018-10-24 发布 2018-10-24 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 122018 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：周智、王传彬、杨林、吴佳俊、宋晓
2、晖、翟新验、倪建强、刘玉良、张硕、刘颖昳、赵柏林、顾小雪、曲萍。T/CVMA 122018 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR诊断技术、鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR诊断技术。本标准主要用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方
3、法 GB/T 25172 猪常温精液生产与保育技术规范 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行 3 试剂与耗材 3.1 RNA 提取试剂 RNA提取试剂详见附录A，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。3.2 其他试剂 Taq DNA聚合酶（5 U/L），PrimeScriptTM RT Mix反转录酶混合物，50 ROX Reference Dye,2 One Step RT-PCR Buffer缓冲液，无水乙醇，无菌无核酸酶水，生理盐水。3.3 引物探针 3.3.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR 引物和探针，见表 1。表1 猪繁殖与呼吸
4、综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR 引物和探针序列 名称 序列（5-3）美洲型上游引物（NAF）TGGARATTCATCACCTCCAGR 美洲型下游引物（NAR）GTGCCGTTRACCGTAGTGGA 欧洲型上游引物（EUF）ACTTCCAGATGCAGATTGTGT 欧洲型下游引物（EUR）GCCGTTCACTGATGTTAGTCC 探针 FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCAYCA-BHQ 注：将表中引物和探针用无菌无核酸酶水稀释至10 pmol/L后使用。3.3.2 美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光 RT-PCR 引物和探针,见表 2。表2
5、 美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光 RT-PCR 引物和探针序列 T/CVMA 122018 2 名称 序列（5-3）美洲型和欧洲型上游引物（NAF-EUF）CGCCAGCCAGTCAATCARC 美洲型和欧洲型下游引物（NAR-EUR）GRGGAAAATGKGGCTTCTCMG 欧洲型探针 FAM-TCCTCCCCTRGGTTGCTGGCGCT-BHQ 美洲型探针 HEX-YCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-BHQ 注：将表中引物和探针用无核酸酶的灭菌蒸馏水稀释至10 pmol/L后使用。4 仪器与设备 分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨器、-20冰箱、可调
6、移液器。5 操作步骤 5.1 样品采集 5.1.1 组织样品采集 组织样品采集按照NY/T 541进行。取病死猪肺脏、淋巴结、扁桃体等组织；待检活猪，采集血液3 mL5 mL，也可采取扁桃体样品。5.1.2 公猪精液采集 公猪精液采集按照GB/T 25172的方法进行。5.2 样品的处理 5.2.1 组织样品处理 每份组织分别从三个不同的典型病变位置处称取样品约1 g，剪碎混匀后取0.02 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，6 000 g离心2 min，吸取上清液到新的离心管备用。5.2.2 血液样品处理 将采集的血液室温或者37 倾斜放置，待血清析
7、出后吸取上清液到新的离心管备用。5.2.3 精液样品处理 精液样品无需处理，直接用于核酸提取。5.2.4 阳性对照样品处理 取美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性组织研磨上清液各100 L(病毒含量105.0 TCID50/mL)，用于病毒RNA提取。5.2.5 阴性对照样品处理 取猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性组织研磨上清液100 L，用于病毒RNA提取。5.3 病毒 RNA 提取 T/CVMA 122018 3 5.3.1 若选用附录 A 中所列试剂提取病毒 RNA，则参照以下步骤进行操作：a)取已处理的样品、阴性对照和阳性对照各 100 L，分别加入裂解液 600 L，充分颠倒混匀，室温
8、静置 3 min5 min。b)将液体吸入吸附柱中，10 000 g 离心 30 s。c)弃去收集管中液体，加入 600 L 洗涤液，10 000 g 离心 30 s。d)重复步骤 c)。e)弃去收集管中液体，10 000 g 离心 2 min，以除去残留的洗涤液。f)将吸附柱移入新的离心管中，向柱中央加入洗脱液 50 L，室温静置 1 min，10 000 g 离心 30 s，离心管中液体即为模板 RNA。5.3.2 若使用病毒 RNA 试剂盒提取病毒 RNA，则按试剂盒说明书进行操作。5.4 实时荧光 RT-PCR 扩增方法 5.4.1 按照表 3 配制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）
9、通用型实时荧光 RT-PCR 扩增反应体系。表3 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR 扩增反应体系 试剂 体积 无菌无核酸酶水 4.3 L 美洲型上游引物（10 pmol/L）0.9 L 美洲型下游引物（10 pmol/L）0.9 L 欧洲型上游引物（10 pmol/L）0.9 L 欧洲型下游引物（10 pmol/L）0.9 L 探针（10 pmol/L）0.6 L 2 One Step RT-PCR BufferIII 缓冲液 12.5 L Taq DNA 聚合酶(5 L)0.5 L PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5 L 50 RO
10、X Reference Dye 0.5 L RNA 模板 2.5 L 总体积 25.0 L 将表3中所有试剂加入荧光RT-PCR反应管后，充分混匀，做好标记。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增所用荧光报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ或None。在荧光PCR仪上按表4所示程序进行扩增反应。表4 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR 扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 42 5 min 1 2 95 10 s 1 3 95 5 s 40 4 60 35 s 注：在每个循环第二步（60 35 s）收集荧光信号。5.4.2 按照表
11、5 配制鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 扩增反应体系。表5 鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 扩增反应体系 T/CVMA 122018 4 试剂 体积 无菌无核酸酶水 5.5 L 美洲型探针（10 pmol/L）0.5 L 欧洲型探针（10 pmol/L）0.5 L 美洲型和欧洲型上游引物（NAF-EUF）（10 pmol/L）1 L 美洲型和欧洲型下游引物（NAR-EUR）（10 pmol/L）1 L 2 One Step RT-PCR BufferIII 缓冲液 12.5 L Taq DNA 聚合酶(5 L)0.5 L Prim
12、eScriptTM RT Enzyme Mix 0.5 L 50ROX Reference Dye 0.5 L RNA 模板 2.5 L 总体积 25.0 L 将表5中所有试剂加入荧光RT-PCR反应管后，充分混匀，做好标记。扩增欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光报告基团为FAM，扩增美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光报告基团为HEX，淬灭基团均为BHQ或None（如果仪器未经HEX校正过，可用VIC代替）。在荧光PCR仪上按表6所示程序进行扩增反应。表6 鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 42 5 min 1 2 95
13、 10 s 1 3 95 5 s 40 4 60 35 s 注：在每个循环第二步（60 35 s）收集荧光信号。6 结果判定 6.1 阈值设定 阈值线设定于阴性对照扩增曲线的最高点。6.2 结果判定 6.2.1 通用型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 结果判定 6.2.1.1 美洲型或欧洲型阳性对照 Ct 值30 并出现特定的扩增曲线，阴性对照无 Ct 值并且无特定扩增曲线，实验结果成立，否则实验结果不成立，实例可参考附录 B.1。6.2.1.2 被检样品 FAM 荧光信号 Ct 值30 并出现特定的扩增曲线为 PRRSV 阳性。6.2.1.3 被检样品 30Ct 值37 并出现特
14、定的扩增曲线，需重新取样提取 RNA，扩增后结果判定仍是可疑的，可判定为阳性。6.2.1.4 被检样品 Ct 值37 时，判定为阴性。6.2.1.5 对于某些未呈现 S 型曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。6.2.2 鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征实时荧光 RT-PCR 结果判定 T/CVMA 122018 5 6.2.2.1 美洲型和欧洲型阳性对照 Ct 值30 并出现特定的扩增曲线，阴性对照无 Ct 值并且无特定扩增曲线，实验结果成立，否则实验结果不成立，实例可参考附录 B.2。6.2.2.2 被检样品若 FAM 荧光信号 Ct 值30 并出现特定的扩增曲线为欧洲型 PRRSV
15、阳性；被检样品若Hex 荧光信号 Ct 值30 并出现特定的扩增曲线为美洲型 PRRSV 阳性。6.2.2.3 被检样品 30Ct 值35 并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取 RNA，扩增后结果判定仍是可疑的，可判定为阳性。6.2.2.4 被检样品 Ct 值35 时，判定为阴性。6.2.2.5对于某些未呈现S型曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。T/CVMA 122018 6 A A 附 录 A（规范性附录）RNA 提取液的配制 A.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液（pH值 8.0）EDTA 18.61 g 灭菌纯化水 80 mL 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌纯化
16、水 加至100 mL A.2 裂解液 异硫氰酸胍 236.4 g 氯化钠 23.2 g 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH值8.0）40 mL 灭菌双蒸水 加至2 000 mL A.3 洗涤液 磷酸氢二钠 143.2 g 磷酸二氢钾 62.4 g 氯化钠 18 g 无水乙醇 6 000 mL 灭菌双蒸水 加至8 000 mL A.4 洗脱液 磷酸氢二钠 143.2 g，磷酸二氢钾 62.4 g 灭菌双蒸水 加至2 000 mL A.5 吸附柱和收集管 吸附柱的离心柱层析膜材质为硅基质膜，厚度0.28 cm；吸附柱的装量为800 L/个。T/CVMA 122018 7 B B 附 录 B（资料性附录）实时荧光 RT-PCR 扩增实例参照 B.1 通用型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增实例参照 B.2 鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR扩增实例参照 _