1、ICS 71.100.70 C2682 Y42 上 海 日 用 化 学 品 行 业 协 会 团 体 标 准 T/SHRH 006-2018 _ 化妆品-自由基（DPPH）清除实验方法 Cosmetics-Free Radical(DPPH)Scavenging Test Method 2018-12-01 发布 2018-12-30 实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言 2 1.范围 3 2.原理 3 3.仪器 3 4.试剂 3 5 实验方法 3 6.结果计算 4 7.试验有效性验证 4 8.结果报告 4 2 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出规则起草。本标准由上海
2、日用化学品行业协会提出和归口。本标准起草单位：上海家化联合股份有限公司、东阿阿胶股份有限公司、伽蓝（集团）股份有限公司、上海相宜本草化妆品股份有限公司、上海中翊日化有限公司、上海市质量监督检验技术研究院、玫琳凯（中国）有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物科技有限公司、汉高（中国）投资有限公司、广东博溪生物科技有限公司、上海日用化学品行业协会。本标准主要起草人：陈田、范倩文、曹平、廖峰、吴建铭、吕智、孙培文、林艺青、戴彦韵、万向红、李琼、高宏旗、金坚、陈亦华 3 化妆品-自由基（DPPH）清除实验方法 1.范围 本标准规定了自由基（DPPH）清除实验的基本技术要求。提供一种抗氧化
3、原料的评估方法，适用于宣称具有清除自由基作用的原料的功效评价。2.原理 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（简称DPPH）是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使DPPH乙醇溶液光吸收减弱。DPPH乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系，由此可评价试验样品清除自由基的能力，即抗氧化活性的大小。3.仪器 分析天平：感量 0.1mg；试管：10mL；可调节移液枪：1.00mL；紫外可见分光光度计。4.试剂 除有另外说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。95%乙醇；1,1-二苯基-2-三硝
4、基苯肼（Sigma 公司）；0.12mg/mL DPPH 乙醇溶液：称取 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 12mg 于 250mL 烧杯中，加入 100mL 95%乙醇，用玻棒搅拌至溶解，即得；阳性对照：维生素 E，纯度96%。5.实验方法 阳性对照物用 95%乙醇溶解稀释成：0.08mg/mL、0.04mg/mL、0.02mg/mL、0.01mg/mL 系列浓度梯度用以验证试验系统。受试物处理：水溶性受试物用水稀释为多级浓度样品，油溶性受试物用 95%乙醇稀释为多级浓度样品。参照表 1，使用 10mL 试管设立样品管（T）、样品本底（T0）、DPPH 管（C）和溶剂本底（C0），每一样品的每
5、个受试浓度的样品管（T）需设立 3 支平行管，同时 DPPH 管（C）也需设立 3 支平行管。在样品管（T）和样品本底（T0）中各加入 1mL 相同浓度的样品溶液。4 在所有试管中（T、T0、C、C0）补充溶剂，水溶性样品用水，油溶性样品用 95%乙醇，补足 3mL，混匀。在样品管（T）和 DPPH 管（C）中加入 DPPH 乙醇溶液 1mL，样品本底（T0）和溶剂本底（C0）用 95%乙醇代替，轻轻摇匀，室温下静置 5 分钟。将各支反应溶液移入 1cm 比色皿中，在 517nm 处测定吸光值。表表 1 1 样品加液要求样品加液要求 T-样品管 T0-样品本底 C-DPPH 管 C0-溶剂本底
6、 样品溶液（mL）1 1 水或 95%乙醇溶剂（mL）2 2 3 3 DPPH 乙醇溶液（mL）1 1 95%乙醇（mL）1 1 平行次数 3/样 1/样 3/试验 1/试验 6 结果计算 计算DPPH自由基清除率：%100)T-T-1%00CC（）清除率（1）（1）式中：T样品管吸光值，即样品与 DPPH 反应后溶液吸光值；T0样品本底吸光值；CDPPH 管吸光值 3 次平均值，即未加样品时 DPPH 溶液吸光值；C0溶剂本底吸光值。7.试验有效性验证 每批次实验都需要加入阳性对照的测试，阳性对照维生素 E 的 IC50（达到 50%清除效果时对应的样品受试浓度）应在 0.02mg/mL-0.06mg/mL，则认为试验系统有效。根据公式（1）计算样品在各受试浓度下的自由基清除率，同时统计各组平行管间清除率间的标准差（Standard Deviation，SD），SD 值须3%，则认为试验平行性有效。8 8.结果报告 5 样品在某一受试浓度下的对 DPPH 自由基的清除率应表述为：清除率平均值清除率间的标准差（SD）。对于样品清除自由基活性的表述，不应脱离受试浓度而言。在进行样品间清除自由基活性的比较时，可绘制样品受试浓度与 DPPH 自由基清除率的浓度反应关系曲线，应用拟合公式（R20.9）计算各样品的 IC50，样品 IC50越小代表活性越强。_