1、 ICS 67.120 B 40 团 体 标 准 T/CAAA T/CAAA 0 0606020202121 驴肉及其制品中马源性成分测定驴肉及其制品中马源性成分测定 实时荧光实时荧光 PCRPCR 法法 Identification of Identification of h horse orse d derived erived m materials in aterials in d donkey onkey m meat and eat and p productsroductsRealReal-time PCR time PCR m methodethod 20202121-0 0
2、5 5-2 28 8 发布发布 20202121-0 07 7-1515 实施实施 中国畜牧业协会 发布发布 全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/CAAA 0602021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国畜牧业协会提出并归口。本文件起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东畜牧兽医职业学院、聊城大学、山东东阿国胶堂阿胶药业有限公司、山东东阿天龙食品有限公司、内蒙古阿鲁科尔沁旗太极天驴有限公司、山东骏驰牧业有限公司、山东阿
3、多宝驴产业科技有限公司、禹城市惠民农业科技有限公司。本文件主要起草人：胡悦、张全芳、范阳阳、刘国霞、陈雪燕、刘艳艳、谭晴晴、杨雪、岳鸣鸣、郑艳玲、杜晓霞、提金凤、彭晓蓓、刘桂芹、李兰杰、李艳、卢宗福、钟勇、李建军、马骁、司家勇、董书光、孟朝红、贾涛、王长法、步迅。全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/CAAA 0602021 1 驴肉及其制品中马源性成分测定实时荧光 PCR 法 1 范围 本文件规定了驴肉及其制品中马源性成分测定的原理、试剂或材料、仪器设备、样品、DNA提取实时荧光PCR反应、数据处理和防止交叉污染。本文件适用于驴生鲜肉、冷冻肉及肉制品中马源性成分的测定。2 规范性引用文
4、件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 9695.19 肉与肉制品 取样方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 根据驴、马ckm基因的序列差异，设计通用引物及不同荧光信号的驴、马特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据荧光信号及循环阈值，判定动物源性成分。5 试剂或材料 试剂。除非另有
5、规定外，仅适用分析纯试剂。水。应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。生理盐水。称取29.2 g NaCl 溶解于 80.0 mL水中，加水定容至 100.0 mL，103.4 kPa 蒸汽压（121 ）灭菌 20 min，室温保存待用。动物组织 DNA 提取试剂盒。实时荧光 PCR 检测试剂盒。TaqMan 探针法。实时荧光 PCR 引物和探针。实时荧光 PCR 引物和探针序列见附录 A，目的基因扩增靶标参考序列见附录 B。内参质粒。利用水将人工合成的外源质粒稀释至 2.010-4 ng/L，作为内参质粒，序列参见附录B。6 仪器设备 荧光定量 PCR 仪。3 通道以上，应能检测 JOE
6、、FAM 及 CY5 荧光。紫外分光光度计。分析天平。感量 0.01 mg。离心机。最大转速不应小于 13 000 r/min。水浴锅。高压灭菌锅。7 样品 全国团体标准信息平台T/CAAA 0602021 2 取样 应按GB/T 9695.19的规定执行。试样制备 7.2.1 整块肉取 3.0 g，用生理盐水清洗后，放入研钵中。在研钵中倒入液氮，将样品在液氮中研磨成粉末或用冷冻研磨仪研磨成粉末。7.2.2 碎肉、肉片或肉卷等冷冻混合肉，混匀后，称取 10.0 g 样品，用生理盐水清洗，放入研钵中。在研钵中倒入液氮，将样品在液氮中研磨成粉末。7.2.3 阳性对照样品的制备。取驴肉块、马肉块各
7、3.0 g，分别用生理盐水清洗后，放入研钵中。在研钵中倒入液氮，将样品在液氮中研磨成粉末。7.2.4 阴性对照样品的制备。取牛肉块 3.0 g，用生理盐水清洗后，放入研钵中，在研钵中倒入液氮，将样品在液氮中研磨成粉末。8 DNA 提取 样品 DNA 提取 应采用市售的动物组织DNA提取试剂盒提取。DNA 浓度与纯度的检测 用紫外分光光度计检测提取DNA的浓度与纯度，A260/A280应在1.82.0之间,调整DNA浓度到0.1 ng/L50.0 ng/L范围内。9 实时荧光 PCR 反应 试样源性鉴定实时荧光 PCR 反应 PCR反应体系见附录A，将试剂混匀离心分装至PCR反应管中，放入荧光定
8、量PCR仪，每个PCR反应设置3次平行。对照实时荧光 PCR 反应体系设置 在试样PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照和阳性对照，每个PCR反应设置3次平行。具体如下：空白对照。以水作为空白对照。阴性对照。模板为牛的基因组 DNA 的反应体系作为阴性对照。阳性对照。模板为等量混合的驴、马基因组 DNA 的反应体系作为阳性对照。实时荧光 PCR 反应程序 95 预变性3 min；95 变性10 s，63 退火延伸35 s（收集荧光信号），40个循环。10 数据处理 体系有效性分析 空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明PCR体系有效。空白对照。PCR 体系对应的反应孔均无 JOE
9、、FAM 及 CY5 荧光的典型扩增曲线。阴性对照。PCR 体系对应的反应孔均无 JOE、FAM 荧光的典型扩增曲线，但有 CY5 荧光的典型扩增曲线，且 Ct 值35.0。阳性对照。PCR 体系对应的反应孔中出现 JOE、FAM 和 CY5 荧光的典型扩增曲线，且 Ct 值35.0。结果判定 全国团体标准信息平台T/CAAA 0602021 3 10.2.1 若只有 CY5、JOE 典型荧光扩增曲线，且 Ct 值35.0，则应判定驴肉样品中没有马源性成分。10.2.2 若只有 CY5、FAM 典型荧光扩增曲线，且 Ct 值35.0，则应判定样品中只有马源性成分，无驴源性成分。10.2.3 若
10、只有 CY5 典型荧光扩增曲线，且 Ct 值35.0，无 JOE、FAM 典型扩增曲线，则应判定样品中未检出驴、马源性成分。10.2.4 若有 CY5、JOE、FAM 典型荧光扩增曲线，且 Ct 值35.0，则应判定驴肉样品中混合了马源性成分。10.2.5 若有 JOE 和 FAM 荧光扩增曲线，但 35.0Ct 值40.0，应需要加大模板量进行 PCR 反应。若再次扩增后的 Ct 值40.0，则根据 10.2.110.2.4 判定样品中的动物源性成分，若 Ct 值40.0，则应判定样品中未检出驴、马源性成分。11 防止交叉污染 应按GB/T 27403的规定执行。全国团体标准信息平台T/CA
11、AA 0602021 4 A A 附录A （规范性）实时荧光定性 PCR 引物/探针序列、反应体系 A.1 实时荧光 PCR 引物和探针序列 实时荧光PCR引物和探针序列见表A.1。表A.1 实时荧光定性 PCR 引物和探针序列 引物探针名称 简写 序列（5-3）扩增片段 bp 通用引物-上游 CKMF 5-TCATCGTAGCATCGAGGGG-3 228246 通用引物-下游 CKMR 5-AGCAGAGCAGGAAGGGAGTT-3 内参引物-上游 IMF 5-AGACCACCAAATGCCCCTATC-3 140 内参引物-下游 IMR 5-CGAGATTGAGATCTTCTGCGAC
12、-3 内参探针 IMP 5CY5-GCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGC-3DAB 驴源性探针 Lv-P 5JOE-ATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTAGGCAAAGCCT-3BHQ2 马源性探针 M-P 5FAM-ATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCT-3DAB A.2 试样源性鉴定实时荧光 PCR 反应体系 试样源性鉴定实时荧光PCR反应体系见表A.2。表A.2 试样源性鉴定实时荧光 PCR 反应体系 试剂名称 工作浓度 mol/L 加入体积 L 终浓度 2TaqManMaster Mix 10 1 CKMF/R 5
13、2 0.50 mol/L IMF/IMR 1 2 0.10 mol/L Lv-P（JOE）1 2 0.10 mol/L M-P（FAM）2 2 0.20 mol/L IMP（CY5）1 1 0.10 mol/L 内参质粒CK-3 1 10-3 ng/L 基因组DNA模板 2 1.0 ng100 ng 注：JOE、FAM分别检测驴源性和马源性，CY5为内参探针。全国团体标准信息平台T/CAAA 0602021 5 B B 附录B （资料性）目的基因扩增靶标参考序列 B.1 驴（Equus asinus）PCR 产物序列(Genbank:HQ336263.1)TCATCGTAGCATCGAGGGG
14、AGAGGCTCTCTCTTTCCCGGCCTCTCTCTCCCCATCTCGGAAATAACTGGATCTTTTAAGTCTCTGCTTATCTGTGGGAGCTGATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTAGGCAAAGCCTCCAGGATTTGGGGACTCTGAAATGGGAATACTTTTCGTACCTTGTCACTGGCCCCCTGAAACTCCCTTCCTGCTCTGCT B.2 马(Equus caballus)PCR 产物序列(Genbank:JQ065978.1）TCATCGTAGCATCGAGGGGAGAGGCTCTCTCTTTCCCGGCCTCTCTCTCCCC
15、ATCTCGGAAACAACCGGATCTTTCAAGTCTCTGCTTATCTGTGGGAGCTGATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCTCCAGGATTTGGGGACTCTGAAATGGGAATACTTTTCATACCTTGTCACTGGCCCCCTGAAACTCCCTTCCTGCTCTGCT B.3 内参质粒 AGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCG 注：下划线为引物位置，阴影部分为探针位置。全国团体标准信息平台