1、ICS13.060C 51T/SDAQI团体标准T/SDAQI 0072021生产用水中铜绿假单胞菌的快速定性检测实时荧光 PCR 方法Rapid qualitative detection of Pseudomonas aeruginosa in production waterReal-time PCR method2021-09-25 发布2021-10-25 实施山东质量检验协会发 布全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/SDAQI 0072021I版权说明本文件系由山东质量检验协会（简称“协会”）组织创制的团体标准文本（含制定过程中的草案），协会拥有本文件的著作权，受中华人民共
2、和国著作权法保护。除法律所允许的情形或事先得到协会书面许可外，任何组织和个人不得以任何理由进行复制、销售、传播本文件，或抄袭、歪曲本文件等侵权行为，否则，行为人应承担相应的民事、行政责任，构成犯罪的，将依法追究其刑事责任。其他文件引用本文件，不属侵权行为。凡利用本文件进行或支持贸易、认证等商业活动，应事先购买正式文本或得到协会书面授权。购买本文件或获得授权，请与协会联系。欢迎社会各界举报侵权盗版行为，协会将依法严格保护举报人信息。联系人：范红梅联系电话：0531-8970198615668365153联系邮箱：协会对本版权声明拥有最终解释权。全国团体标准信息平台T/SDAQI 0072021I
3、I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东质量检验协会提出并归口。本文件起草单位：山东省产品质量检验研究院、滨州市食品药品检验检测中心、南京诺唯赞生物科技股份有限公司。本文件主要起草人：王一村、李娜、李秀超、高静静、赵娟、周莉莉、才美佳、张宇鑫、赵彤彤、田洪根、刘红、朱玉兰。本文件的所有权和解释权归山东质量检验协会。如果您在本文件使用中发现错误或技术内容有不当之处，请及时与协会秘书处联系，将意见发送到。全国团体标准信息平台T/SDAQI 007202
4、11生产用水中铜绿假单胞菌的快速定性检测 实时荧光 PCR 法1范围本文件规定了与人、动物健康相关的诸如食品、饲料、饮用水等行业生产用水中铜绿假单胞菌的快速定性检测方法。本文件适用于生产用水中铜绿假单胞菌的快速定性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求GB 19489
5、 实验室 生物安全通用要求3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理样品经抽滤设备过滤后，将过滤后的膜放入选择培养基中培养。收集培养后的菌液进行DNA提取。以DNA为模板，采用细菌16S rDNA基因序列作为内参照，以铜绿假单胞菌中外毒素A（eta）基因中相对保守且高度特异的引物和探针进行目标物的实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否含有铜绿假单胞菌。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。5仪器设备5.1电子天平：感量0.01 g。5.2微量可调移液器。5.3恒温水浴锅。5.4磁力搅拌器。5.5高速冷冻离心机：离心力12 000 g，4。5.6二级
6、生物安全柜。5.7高压灭菌锅。5.8普通冰箱：4，-20。5.9pH计。5.10核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。全国团体标准信息平台T/SDAQI 007202125.11实时荧光定量PCR仪。5.12抽滤设备。5.13无菌滤膜：直径47 mm，微孔径为0.45 m。5.14恒温培养箱：361。6试剂或材料试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T 27403的规定执行。除另有规定外，试剂应为分析纯或化学纯级别，实验用水应符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和 Taqman 探针序列（详见表 1）表 1检测用引物和 Taqman 探针名称序列（53
7、）目的基因内参照5端引物内参照3端引物内参照探针F:5-TTAAGTCCCGCAACGAGC-3R:5-TTGTAGCACGTGTGTAGCCC-3P:5-VIC-TTGACGTCATCCCCACCTTCCTCC-TRAMA-3细菌16S rRNA基因检测用5端引物检测用3端引物检测用探针F:5-AAGGTGTTCATCCACGAACTGA-3R:5-ATGGTGTAGATCGGCGACATG-3P:5-FAM-CCGGTAACCAGCTCAG-MGBNFQ-3铜绿假单胞菌eta基因6.2三氯甲烷。6.3异戊醇。6.4异丙醇。6.5商品化2荧光定量PCR预混液。6.670%乙醇。6.7蛋白酶K
8、：20 mg/L。6.8RNA酶溶液：5 g/L。6.9Tris饱和酚。6.10TE冲液：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。6.11CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，调pH5至8.0。121高压灭菌20 min，备用。6.12假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂：见附录A。7样品7.1水样过滤在百级洁净的工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250 mL水样或稀释液
9、通过孔径0.45 m的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜正向贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡，平行做两份实验。全国团体标准信息平台T/SDAQI 007202137.2培养将平板倒置于361的培养箱中培养24 h48 h，并防止干燥。7.3菌体收集用灭菌的1 mL 0.9的生理盐水洗脱滤膜上的菌落，并将菌液收集于灭菌的2 mL离心管中。重复洗脱一次，将两次菌液合并后进行下一步检测。8试验步骤8.1DNA 提取将上述收集于灭菌的2 mL离心管中的菌液6 000 g离心1 min，弃上清。加入1 000 L CTAB缓冲液和40 L蛋白酶K，震荡混匀，65温浴30 m
10、in，每隔10 min振荡混匀。12 000 g离心10 min，吸取1 mL上清液至2 mL离心管中，勿吸取管内杂质。向离心管中加入500 L体积比为25：24：1的酚-三氯甲烷-异戊醇的混合液（现用现配），剧烈震荡，12 000 g离心12 min。吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，剧烈震荡，12 000 g离心10 min。弃上清液，用65预热的双蒸水溶解DNA。加入5 L RNA酶，37温浴30 min。加入200 L体积比为24：1的三氯甲烷-异戊醇混合液，剧烈震荡，12 000 g离心12min。吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，震荡均匀，12 000 g离心1
11、0 min。弃上清，70%乙醇洗涤一次，12 000 g离心1 min。弃上清液，晾干后加入50 L TE缓冲液溶解DNA，-20保存。DNA提取也可使用等效的DNA提取试剂盒替代。8.2DNA 浓度及纯度的测定取适量的DNA模板溶液加双蒸水稀释一定倍数后，使用紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸光值A260和A280，DNA浓度计算按式（1）计算，C=AN50(1)式中：C-DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/L）；A-260 nm处的吸光值；N-核酸稀释倍数；50-吸光值A260为1时，相对应双链DNA的浓度常数；当A260/A280比值在1.82.0之间时，DNA模板适宜荧
12、光定量PCR扩增。若检测DNA模板浓度不在规定范围内，可适当增加样品采样量或增加荧光定量PCR反应过程中模板量或减少溶解DNA的溶剂的量，提高浓度，以保证检测的有效性。8.3实时荧光 PCR 检测8.3.1实时荧光 PCR 反应体系表 2实时荧光 PCR 反应体系试剂成分体积（单位：L）2荧光定量PCR预混液12.5引物F（10 M）0.6引物R（10 M）0.6探针P（5 M）0.3全国团体标准信息平台T/SDAQI 00720214试剂成分体积（单位：L）样品DNA（10 ng/L100 ng/L）1dd H2O补至 258.3.2实时荧光 PCR 反应参数95预变性3 min；95变性5
13、 s，60退火40 s，45个循环。8.3.3实验对照检验过程中分别设内参照、阳性对照、阴性对照、空白对照。以荧光假单胞菌的DNA为内参照、以铜绿假单胞菌标准菌株或构建的标准质粒DNA为阳性对照、以其他细菌的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。所有反应均设置两个平行反应体系。9质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效，需重新进行实验。a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值40.0；b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值40.0；c)阳性对照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0；d)内参照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.
14、0。10结果判定及表述10.1结果判定在符合第9部分的情况下，被检样品进行检测时：a)如两个平行样品Ct值均35.0，则判定为被检样品阳性；b)如两个平行样品Ct值均40.0，则判定为被检成分阴性；c)如35.0Ct值40.0，判为结果可疑，需要重新检测。重新检测需从7.1开始重新检测，由于为定性检测，可从多个方面提高检测率，根据各种具体情况在可选使用量的几个因素中重新调整优化检测过程，如增加样品取样量、减少溶解DNA的TE剂量，增加PCR反应中加入的模版量、适量增加PCR反应循环数等。如再次扩增后Ct值仍为40.0，则判定相应被检成分阳性；如再次扩增后Ct值40.0，则判定相应被检成分阴性。
15、10.2结果表述10.2.1结果为阳性者，表述为每250 mL水中“检出铜绿假单胞菌”。10.2.2结果为阴性者，表述为每250 mL水中“未检出铜绿假单胞菌”。11防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。全国团体标准信息平台T/SDAQI 00720215附录A(规范性)假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂A.1成分表 A.1 成分成分用量明胶胨16.0 g胰蛋白胨10.0 gK2SO410.0 gMgCl21.4 g甘油10 mL琼脂15 g20 g蒸馏水1 000 mLCN补充成分溴化十六烷基三甲铵(cetrimide)0.2 g萘啶酮酸0.015 gA.2制法将明胶胨、胰蛋白胨、K2SO4、MgCl2、琼脂溶解于1 000 mL蒸馏水中，加入10 mL甘油,加热煮溶并高压蒸汽灭菌(121，15 min)。灭菌后，待培养基冷却至4550时，加入溶于2 mL灭菌蒸馏水的CN补充成分，与尚处于融溶状态的基础培养基混合，倾注到灭菌平板上，培养基厚度至少高5 mm，培养基的最终pH应在7.10.2范围内（温度为25时）。将制备好的平板置于黑暗处，于28保存，同时防止干燥，在1月内使用。不要使培养基保持融溶状态超过4 h。不得再次煮融培养基。AAB全国团体标准信息平台