1、柴胡种子 DNA 分子鉴定规程DNA Molecular Identification Rules of Bupleuri Seed2021-05-20 发布2021-06-01 实施ICS65.020.01CCSB 21团体标准团体标准T/SAIA 001-2021山东省农业产业化促进会发布全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/SAIA001-2021I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理方法.15仪器设备及试剂.15.1仪器设备.25.2试剂.26检测引物和探针.27DNA 提取.28核酸浓度及纯度测定.39实时荧光 PCR 扩增.39.1反应体系.39
2、.2实时荧光 PCR 反应程序.310结果分析与判定.310.1PCR 的有效性判定.310.2DNA 提取有效性判定.310.3样品检测结果分析和判定.411检测过程中防止交叉污染的措施.4附录 A（规范性附录）仪器设备.5附表 B（规范性附录）试剂及试剂的配置.6表 B.1试剂.6表 B.2试剂的配置.6全国团体标准信息平台T/SAIA001-2021II前言前言本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东农业科学院生物技术研究中心提出。本文件由
3、山东省农业产业化促进会归口。本文件起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东中医药大学、山东冰斛农林科技有限公司、山东百味堂中药饮片有限公司、恒德本草（中国）有限公司、济南越林果蔬种植专业合作社、山东鲁山神农药谷文化传播有限公司、北京炎黄医养科技有限公司、东营凌峰农业科技发展有限公司。本文件主要起草人为：张全芳、高德民、姜秀梅、步迅、崔彦伟、刘国霞、陈雪燕、胡悦、曹海禄、范娅、杜衎、刘丽、孙燕、张愫、刘艳艳、谭晴晴、范阳阳、葛付存、赵霞、姚川、侯昊伟、西曰江。本文件附录 A、B 为规范性附录。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台T/SAIA001-20211柴胡种子 DNA 分子鉴定规
4、程1范围本文件规定了柴胡种子 DNA 分子鉴定的实时荧光 PCR 技术原理方法和操作规程。本文件适用鉴定中药材北柴胡和狭叶柴胡种子的真实性。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1柴胡Radix Bupleuri中药名，为伞形科植物北柴胡Bupleurum chinenseDC.或狭叶柴
5、胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根。按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”。注 1：中国药典（2020 年版）收载有北柴胡Bupleurum chinenseDC.和狭叶柴胡Bupleurumscorzo-nerifoliumWilld.注 2：三岛柴胡BupleurumfalcatumL.是伞形科、柴胡属植物，是日本引进品种，为日本汉方柴胡的主要来源。3.2实时荧光PCR Real-time PCR在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个 PCR 扩增过程。3.3Ct 值Cycle threshold每个反应管内的荧光信号达
6、到设定的阈值时所经历的循环数。4原理方法基于实时荧光 PCR 技术，建立多重实时荧光 PCR 检测体系，采用 DNA 条形码中的 ITS 基因序列为靶基因，设计柴胡的通用引物与探针以及狭叶柴胡和北柴胡的特异性引物和探针，通过对荧光聚合酶链式反应反应体系和反应条件的优化筛选，建立了多重实时荧光聚合酶链式反应方法，在同一聚合酶链式反应反应体系中可以同时鉴别狭叶柴胡、北柴胡种子的源性成分。5仪器设备及试剂全国团体标准信息平台T/SAIA001-202125.1仪器设备仪器设备见附录表 A.1。5.2试剂5.2.1试剂见附录 B.1。5.2.2试剂的配制方法见附录 B.2。5.2.3在分析中仅使用确认
7、为分析纯的试剂和符合 GB/T6682 规定的一级水。6检测引物和探针引物序列和探针，见表 1表 1 引物和探针序列引物探针名称序列（5-3）扩增片段（bp）特征BSFCAGAATCCCGTGAACCATCG135狭叶柴胡通用引物BSRTAAACCAGCCGCACGACGBSPJOE-CCTCCGCAGCTCGCTCGAAG-BHQ2狭叶柴胡特异探针BCFCGTCGTGCGGCTGGTTTA113北柴胡通用引物BCRTTGCTCACAGAGTAAACGGGCTBCPFAM-AAGAGAGTCACCGGAGATCGGAAAAC-BHQ1北柴胡特异探针BUFAAACGACTCTCGGCAACG14
8、5柴胡属通用引物BURCGTGCCCTCAGCCTAATGBUPROX-CGTAGCGAAATGCGATACTTGGTG-BHQ2柴胡属特异探针7DNA 提取每份材料混合取 0.3g，用灭菌后的研钵在液氮状态下研磨成粉末。将含有 2%-巯基乙醇的 CTAB提取缓冲液置于 65水浴锅中预热；将研磨好的样品取 0.15g 置于 2.0mL 的离心管中；加入 700L 65预热的 CTAB 提取缓冲液，65保温 30 min，期间摇动 3-4 次；加入 700L 氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒使其充分混匀，12000r/min 离心 10min，吸取上清液转移至另一个离心管中；将上清液转移到新的
9、离心管中，加入 2/3 体积的-20预冷的异丙醇，将其充分混匀，置于-20 30min 或过夜，12000r/min 离心 15 min，收集沉淀；加入 700 L 70%无水乙醇漂洗，12000r/min 离心 2min，弃掉上清液，此步骤重复一遍；室温下或超净工作台中自然风干 DNA5-10 min；加入 50 L 的双蒸水或 TE 缓冲液，涡旋振荡充分混匀，12000r/min 离心 2 min，4保存备用或置于-20保存。其他，可用相关植物提取试剂盒进行北柴胡和狭叶柴胡种子 DNA 的提取。全国团体标准信息平台T/SAIA001-202138核酸浓度及纯度测定用 Nanodrop 紫外
10、分光光度计对提取的 DNA 进行核酸浓度与纯度检测，OD260nm和 OD280nm处测定其吸光值，OD260/280比值在 1.71.9，说明提取种子 DNA 纯度为佳。DNA 浓度控制在 0.150ng/L 之间，可作相应稀释以调整其浓度。注：用于 PCR 反应的 DNA 溶液 OD260/OD280比值一般不低于 1.5，低于 1.5 时则重新进行 DNA 的提取。9实时荧光 PCR 扩增9.1 反应体系按照表 2 依次加入试剂，配制 PCR 反应体系，混匀离心分装至 PCR 反应管中，加入基因组 DNA 模板，8000 r/min 离心 1min，取出 PCR 管放入荧光定量 PCR
11、仪中。每个 PCR 反应设置 3 个平行。表 2 实时荧光 PCR 反应体系组分名称加量（L）终浓度TaqManMaster Mix101BCF/R(10mol/L)10.50mol/LBSF/R(10mol/L)10.50mol/LBUF/R(10mol/L)10.50mol/LBCP（FAM）（0.4mol/L）10.02mol/LBSP（JOE）（5mol/L）10.25mol/LBUP（ROX）（1mol/L）10.05mol/L基因组 DNA 模板(0.1ng/L20.0ng/L)20.2ng40.0ng双蒸水补至 20L9.2实时荧光 PCR 反应程序95 1 min；45 个循环
12、，955 s，60 35 s，在此收集荧光信号。10结果分析与判定10.1PCR 的有效性判定在试样 PCR 反应的同时，设置如下阴性对照、空白对照和阳性对照。阴性对照：以三岛柴胡作为阴性对照。PCR 体系对应的反应孔均无 FAM、JOX，相应 Ct 值40.0，有通用探针 ROX 的荧光信号，且 Ct 值35.0 说明 PCR 体系有效性。空白对照：以水作为空白对照。PCR 体系对应的反应孔均无 FAM、JOX、ROX，说明 PCR 体系有效性。阳性对照：以狭叶柴胡柴胡/北柴胡 50 ng/L DNA 作为阳性对照。PCR 体系对应的反应孔中均有 FAM、ROX、JOX，且 Ct 值35.0
13、 说明 PCR 体系有效性。注：每个 PCR 反应设置 3 次平行。10.2DNA 提取有效性判定在同时进行空白对照、阴性对照和阳性对照实验结果正常情况下，被检测样品应有相应荧光信号检全国团体标准信息平台T/SAIA001-20214出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，满足 Ct 值35.0。10.3样品检测结果分析和判定在符合 10.2 的情况下，使用 PCR 反应体系对狭叶柴胡、北柴胡种子源性成分鉴定：当羧基荧光素 FAM 和罗丹染料 ROX 荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足 Ct 值35 说明检出北柴胡种子源性成分；当 JOE、ROX 荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足 Ct 值35 说
14、明检出狭叶柴胡种子源性成分。当只有 ROX 荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足 Ct35 说明待检样本为伪品柴胡种子；如Ct 值40.0，则判定为未检出相应的源性成分；如 35.0Ct 值40.0，则需要重复实验，再次扩增后的 Ct 值仍135 6pH计pH测量范围0.0014.007磁力搅拌器转速范围01500 rpm全国团体标准信息平台T/SAIA001-20216附表B（规范性附录）试剂及试剂的配置试剂，见表 B.1。试剂的配置，见表 B.2。表 B.1 试剂序号试剂名称备注1十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）2氯仿/异戊醇（24:1）3乙二胺四乙酸二钠（EDTA）4B.4 2%-巯基乙醇5
15、氢氧化钠（NaOH）6浓盐酸7氯化钠（NaCl）8Tris碱9异丙醇10无水乙醇表 B.2 试剂的配置序号试剂名称配置方法备注170%乙醇溶液取70ml无水乙醇，加水定容至100ml。21mol/L Tris-HCl 溶 液（pH 8.0）称取12.11g Tris碱，溶于800 mL的双蒸水中，用浓盐酸溶液调PH至8.0（约需4.2ml浓盐酸），加水定容至100mL，在103.4kPa、121条件下，灭菌20min后使用。310 mol/L 氢氧化钠溶液称取40 g氢氧化钠（NaOH）溶于80 mL的双蒸水中，搅拌，定容至100mL，待用。40.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）溶液
16、（pH 8.0）称取二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2H2O）18.61g加入80 mL双蒸水，不断搅拌，加入7 mL 10 mol/L氢氧化钠溶液，PH调至 8.0，最后加入双蒸水定容到100 mL，高温灭菌20min。全国团体标准信息平台T/SAIA001-20217表 B.2（续）55 mol/L氯化钠溶液称取氯化钠（NaCl）29.22 g，将其溶于90 mL的双蒸水中，加热使其溶解，冷却，然后用双蒸水定容至100 mL，高温灭菌20min，待用。610%十六烷基三甲基溴化铵溶液称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）10g，溶解于80 mL双蒸水，加热加速溶解，双蒸水定容至100 mL，室温保存。7CTAB提取缓冲液取10%CTAB溶液 30 mL（4.2.7），1 mol/LTris-HCl溶液（PH 8.0）10 mL（4.2.3），0.5 mol/L EDTA（PH 8.0）4 mL（4.2.5），5 mol/L氯化钠溶液28 mL（4.2.6），定容至100 mL，高温灭菌20min，-巯基乙醇现配现用。8TE缓冲液在80mL水中依次加入1mol/L Tris-HCl