1、ICS65.120B 46T/SDAQI团体标准T/SDAQI 0432021饲料中沙门氏菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌三重荧光定量 PCR 快速检测方法Detection of salmonella,vibrio parahaemolyticus and shigella in animal feed byReal-time PCR2021-09-25 发布2021-10-25 实施山东质量检验协会发 布全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/SDAQI 0432021I版权说明本文件系由山东质量检验协会（简称“协会”）组织创制的团体标准文本（含制定过程中的草案），协会拥有本文件的著作权，受
2、中华人民共和国著作权法保护。除法律所允许的情形或事先得到协会书面许可外，任何组织和个人不得以任何理由进行复制、销售、传播本文件，或抄袭、歪曲本文件等侵权行为，否则，行为人应承担相应的民事、行政责任，构成犯罪的，将依法追究其刑事责任。其他文件引用本文件，不属侵权行为。凡利用本文件进行或支持贸易、认证等商业活动，应事先购买正式文本或得到协会书面授权。购买本文件或获得授权，请与协会联系。欢迎社会各界举报侵权盗版行为，协会将依法严格保护举报人信息。联系人：范红梅联系电话：0531-8970198615668365153联系邮箱：协会对本版权声明拥有最终解释权。全国团体标准信息平台T/SDAQI 043
3、2021II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东质量检验协会提出并归口。本文件起草单位：山东省产品质量检验研究院、滨州市食品药品检验检测中心。本文件主要起草人：李娜、王一村、周莉莉、高静静、才美佳、赵彤彤、张宇鑫、侯广月、康兆广、徐正、孙全胜、张鑫、朱富强。本文件的所有权和解释权归山东质量检验协会。如果您在本文件使用中发现错误或技术内容有不当之处，请及时与协会秘书处联系，将意见发送到。全国团体标准信息平台T/SDAQI 04320211饲料中沙门
4、氏菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌三重荧光定量 PCR 快速检测方法1范围本文件规定了宠物饲料中沙门氏菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌的三重快速检测方法。本文件适用于宠物饲料产品。本方法检出限分别为沙门氏菌10 CFU/g、副溶血性弧菌20 CFU/g、志贺氏菌20 CFU/g。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T 19495.2转基因
5、产品检测 实验室技术要求GB 19489实验室 生物安全通用要求3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理样品经增菌培养，收集培养后的增菌液进行DNA提取。以DNA为模板，采用细菌16S rDNA基因序列作为内参照，以沙门氏菌中invA基因、副溶血性弧菌tlh基因和志贺氏菌ipaH基因中相对保守且高度特异的序列设计引物与探针，进行目标物的三重实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否含有沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。5仪器设备5.1电子天平，感量 0.01 g。5.2微量可调移液器（最大量程为 10 L、20
6、L、100 L、1000 L）。5.3恒温水浴锅。5.4磁力搅拌器。5.5高速冷冻离心机：最高离心力不低于 12000 g。5.6二级生物安全柜。全国团体标准信息平台T/SDAQI 043202125.7高压灭菌锅。5.8普通冰箱：4，-20。5.9pH 计。5.10核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5.11实时荧光定量 PCR 仪。5.12恒温培养箱：361。6试剂或材料试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T 27403的规定执行。除另有规定外，试剂应为分析纯级别，实验用水应符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和 Taqman 探针序列（详见表
7、 1）表1 检测用引物和Taqman探针名称序列（53）目的基因内参照5端引物内参照3端引物内参照探针F:5-TTAAGTCCCGCAACGAGC-3R:5-TTGTAGCACGTGTGTAGCCC-3P:5-VIC-TTGACGTCATCCCCACCTTCCTCC-BHQ1-3原核生物16S rDNA基因沙门氏菌5端引物沙门氏菌3端引物沙门氏菌探针F:5-CTCAACTTGCGGAGCGTCTAC-3R:5-CGGAATAATTTACCACTCGCATC-3P:5-HEX-CGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGAT-BHQ1-3沙门氏菌inv A基因副溶血性弧菌5端引物副溶血性弧
8、菌3端引物副溶血性弧菌探针F:5-ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA-3R:5-GATGAGCGGTTGATGTCCAA-3P:5-CY5-CGCGTTCACGAAACCGTGC-MGBNFQ-3副溶血性弧菌tlh基因志贺氏菌5端引物志贺氏菌3端引物志贺氏菌探针F:5-TGGTCCATCAGGCATCAGAAG-3R:5-CTGCGAGCATGGTCTGGAA-3P:5-FAM-TAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCC-BHQ1-3志贺氏菌ipaH基因6.2十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）缓冲液：55 mmol/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，20 mm
9、ol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），100 mmol/L Tris，调 pH 至 8.0。121高压灭菌 20 min，备用。6.3TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。6.4蛋白酶 K：20 mg/L。6.5RNA 酶溶液：5 g/L。6.6Tris 饱和酚。6.7三氯甲烷。6.8异戊醇。6.9异丙醇。6.1070%乙醇。6.11商品化 2荧光定量 PCR 预混液。6.12营养肉汤培养基：见附录 A。7试验步骤全国团体标准信息平台T/SDAQI 043202137.1预增菌称取 10 g 饲料样品充分粉碎混合均匀后，于
10、 90 mL 营养肉汤中 361培养 18 h24 h 进行预增菌。取培养好的增菌液进行 DNA 提取。固体样品要充分粉碎研磨，必要时用液氮研磨。7.2DNA 提取量取1 mL1.5 mL已培养好的增菌液于2.5 mL离心管中，加入1 000 L CTAB缓冲液和40 L蛋白酶K，震荡混匀，65温浴30 min，每隔10 min振荡混匀。12 000 g离心10 min，吸取1 mL上清液至2 mL离心管中，勿吸取管内杂质。向离心管中加入500 L体积比为25:24:1的酚-三氯甲烷-异戊醇的混合液，剧烈震荡，12 000 g离心12 min。吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，剧烈震
11、荡，12 000 g离心10 min。弃上清液，用65预热的双蒸水溶解DNA。加入5 L RNA酶，37温浴30 min。加入200 L体积比为24:1的三氯甲烷-异戊醇混合液，剧烈震荡，12 000 g离心12 min。吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，震荡均匀，12 000 g离心10 min。弃上清，70%乙醇洗涤一次，12 000 g离心1 min。弃上清液，晾干后加入50 L TE缓冲液溶解DNA，-20保存。DNA提取也可使用等效的DNA提取试剂盒替代。7.3DNA 浓度及纯度的测定取适量的DNA模板溶液加双蒸水稀释一定倍数后，使用紫外分光光度计测定260 nm和280
12、nm处的吸光值A260和A280，DNA浓度计算按式（1）计算，C=AN50(1)式中：C-DNA浓度，单位为微克每微升（ng/L）；A-260 nm处的吸光值；N-核酸稀释倍数；50-吸光值A260为1时，相对应双链DNA的浓度常数；当A260/A280比值在1.82.0之间时，DNA模板适宜荧光定量PCR扩增。若检测DNA模板浓度不在规定范围内，可适当增加样品采样量或增加荧光定量PCR反应过程中模板量或减少溶解DNA的溶剂的量，提高浓度，以保证检测的有效性。7.4实时荧光 PCR 检测7.4.1实时荧光 PCR 反应体系表 2 实时荧光 PCR 反应体系试剂成分体积（单位：L）2荧光定量P
13、CR预混液引物F各（10 M）引物R各（10 M）探针P各（5 M）样品DNA（10 ng/L100 ng/L）ddH2012.50.50.50.21补至 257.4.2实时荧光 PCR 反应参数95预变性5 min；95变性5 s，60退火30 s，45个循环。7.4.3实验对照全国团体标准信息平台T/SDAQI 04320214检验过程中分别设内参照、沙门氏菌阳性对照、副溶血性弧菌阳性对照、志贺氏菌阳性对照、阴性对照、空白对照。以任一细菌的DNA为内参照、以沙门氏菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌提取的DNA分别为阳性对照、以其他细菌提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。8质量控制以下条件有
14、一条不满足时，实验视为无效，需重新进行实验。a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值40.0；b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值40.0；c)沙门氏菌阳性对照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0；d)副溶血性弧菌阳性对照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0；e)志贺氏菌阳性对照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0；f)内参照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0。9结果判定及表述9.1结果判定在符合第7部分的情况下，被检样品进行检测时：a)如沙门氏菌invA基因Ct值
15、35.0，则判定为被检样品沙门氏菌检出；b)如副溶血性弧菌tlh基因Ct值35.0，则判定为被检样品副溶血性弧菌检出；c)如志贺氏菌ipaH基因Ct值35.0，则判定为被检样品志贺氏菌检出；d)如Ct值40.0，则判定相应被检源性成分阴性；e)如35.0Ct值40.0，判为结果可疑，需要重新检测。重新检测需从提取DNA开始重新检测，由于为定性检测，可从多个方面提高检测率，根据各种具体情况在可选使用量的几个因素中重新调整优化检测过程，如增加样品取样量、减少溶解DNA的TE剂量，增加PCR反应中加入的模版量、适量增加PCR反应循环数等。如再次扩增后Ct值仍为40.0，则判定相应被检致病菌为阳性；如
16、再次扩增后Ct值40.0，则判定相应被检成分阴性。9.2结果判定和表述表 3 结果的判定和表述FAM荧光（志贺氏菌）CY5荧光（副溶血性弧菌）HEX荧光（沙门氏菌）结果判定结果表述+有FAM、CY5和HEX荧光同时被检出，且Ct值均35.0。表明从样品中同时检出沙门氏菌、副溶血性弧菌和志贺氏菌。+-有FAM和CY5荧光同时被检出，但无HEX荧光，且Ct值均35.0。表明从样品中同时检出志贺氏菌和副溶血性弧菌，但未检出沙门氏菌。+-+有FAM和HEX荧光同时被检出，但无CY5荧光，且Ct值均35.0。表明从样品中同时检出沙门氏菌和志贺氏菌，但未检出副溶血性弧菌。-+有HEX和CY5荧光同时被检出，但无FAM荧光，且Ct值均35.0。表明从样品中同时检出沙门氏菌和副溶血性弧菌，但未检出志贺氏菌。全国团体标准信息平台T/SDAQI 04320215FAM荧光（志贺氏菌）CY5荧光（副溶血性弧菌）HEX荧光（沙门氏菌）结果判定结果表述+-只有FAM荧光被检出，且Ct值均35.0，但无HEX和CY5荧光。表明从样品中只检出志贺氏菌成分，但未检出沙门氏菌和副溶血性弧菌。-+-只有CY5荧光，且Ct