1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 团体标准 T/SHZSAQS 001342022 绵羊 FecB 基因标记辅助选择育种 技术规程 2022-10-05 发布 2022-10-05 实施 石河子市质量标准化协会 发 布 全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 001342022 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 3.1 多羔.1 3.2 FecB 基因.1 3.3 标记辅助选择.1 3.4 主效基因.1 3.5 限制性内切酶.2 3.6 限制性片段长度多态性.2 4 主要试剂配制.2 5 主要仪器.2 6 FecB 基因标记辅助选择
2、育种方法.2 6.1 样本采集.2 6.2 基因组 DNA 提取.3 6.3 基因组 DNA 质检.3 6.4 PCR 引物序列及引物配制.3 6.5 PCR 扩增体系.3 6.6 PCR 扩增反应循环参数.3 6.7 PCR 产物的电泳检测.3 6.8 RFLP 酶切分析.3 6.9 酶切产物电泳分析.4 6.10 基因分型结果的判定.4 6.11 标记辅助选择育种.4 7 废弃物的处理.4 8 人员防护措施.4 全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 001342022 II 前 言 本文件参照GB/T1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则起草。本文
3、件起草单位：新疆农垦科学院畜牧兽医研究所。本文件主要起草人：杨华、杨永林、余乾、张宾、郑晶晶、张姁。全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 001342022 1 绵羊 FecB 基因标记辅助选择育种技术规程 1 范围 本文件规定了绵羊FecB基因标记辅助选择育种的术语与定义及主要试剂配制、主要仪器、FecB基因标记辅助选择育种方法、废弃物的处理、人员防护措施等。适用于绵羊FecB基因标记辅助选择育种。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用
4、于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 31190 实验室废弃化学品收集技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义和缩略语适用于本文件。3.1 多羔 指母羊一胎分娩出两只或两只以上的羔羊。3.2 FecB 基因 是骨形态发生蛋白IB型受体（BMPR-IB）基因A746G位点碱基突变的B等位基因，该基因是绵羊多羔主效基因，存在BB、B+和+三种基因型，对绵羊排卵率呈加性效应，对胎产羔数呈部分显性效应。与低繁殖力绵羊品种相比，BB基因型母羊平均每胎多产1.5只羔羊；B+基因型母羊平均每胎多产1.0只羔羊；+基因型母羊的产羔数与低繁殖力绵羊品种相同。3.3 标记辅助选择 指利用
5、与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择的育种技术。3.4 主效基因 指对某一数量性状或阈性状的表型值产生较大遗传效应的单个基因或基因座。全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 001342022 2 3.5 限制性内切酶 全称限制性核酸内切酶，是一类能够识别并附着双链DNA分子中特定脱氧核苷酸序列，并由此切割DNA双链磷酸二酯键的一类酶。3.6 限制性片段长度多态性 简称RFLP分析，指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起。4 主要试剂配制 4.1 2%EDTA抗凝剂：称量2gEDTANa2加入90ml去离子水中，溶
6、解以后调pH至7.0，加水定容至100ml，溶液经高压灭菌，分装至无菌的1.5ml2ml离心管中，-20保存备用。4.2 50TAE电泳缓冲液（pH8.5）：称量242gTris和37.2gNa2EDTA2H2O至1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解。加入57.1ml醋酸，充分搅拌。补加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。4.3 1TAE电泳缓冲液：量取20ml50TAE电泳缓冲液，加980ml去离子水，充分混匀备用。4.4 50ml琼脂糖凝胶：根据制胶量及凝胶浓度，称量琼脂糖粉，置于200ml 三角烧瓶中，加入50ml1TAE电泳缓冲液，混匀。将三角烧瓶放入微波炉里(
7、或电炉上)加热3min5min，当溶液沸腾，取出摇晃混匀，重复2次3次使琼脂糖充分熔化。待溶液冷却至60左右，加入适量核酸染料，混匀以后倒入凝胶托盘中，插入梳子，完全冷却凝固30min60min后备用。5 主要仪器 主要仪器包括单道可调移液器，电子天平，紫外分光光度计，高速离心机，PCR仪，凝胶成像分析系统，稳压稳流电泳仪电源，水平电泳槽。6 FecB 基因标记辅助选择育种方法 6.1 样本采集 全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 001342022 3 用一次性无菌注射器采集初生羔羊颈静脉血1ml1.5ml，收集于含100 l的2%EDTA抗凝剂的离心管中，盖上管盖，上下充分颠倒混匀，详
8、细记录样品信息，离心管壁标记羊号或编号。样本在-20保存不超过2年。6.2 基因组 DNA 提取 冷冻的抗凝血在室温融化，取200 l抗凝血，按照市售商品化的试剂盒说明书提取基因组DNA。6.3 基因组 DNA 质检 取提取的1 l基因组DNA，应用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组提取效果，合格的基因组DNA在电泳图谱上呈清晰、单一的条带，没有拖尾。应用紫外分光光度计测量基因组DNA 260nm和280nm的OD值，合格的基因组DNAOD260/OD280的比值应为1.8。6.4 PCR 引物序列及引物配制 上 游 引 物 序 列：CCAGAGGACAATAGCAAAGCAAA，下 游 引 物
9、序 列：CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC，PCR产物大小为190bp。上、下游引物用灭菌去离子水（ddH2O）稀释为10 M，短期保存于4，长期保存于-20。6.5 PCR 扩增体系 2Taq PCR MasterMix为市售商品化的2TaqE预混液（包含Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTP Mixture、MgCl2的2倍浓度混合物）。PCR扩增体系总体积为25 l，2Taq PCR MasterMix 12.5 l，上游引物1 l，下游引物1 l，50 ng/l基因组DNA模板2 l，ddH2O 8.5 l。同时设置阴性和阳性对
10、照反应，以保证检测结果的准确性。6.6 PCR 扩增反应循环参数 在PCR仪上设置反应参数为：94 5min；9430s，6030s，7230s，35个循环；72 5min；4保存。6.7 PCR 产物的电泳检测 PCR反应结束后取PCR产物5 l，加入1 l 6DNA Loading Buffer，电泳时留一孔加入5 l标准分子量pUC19 DNA/Msp(Hap)marker，配制1.5%琼脂糖凝胶，以5V/cm恒压、约30min电泳检测，电泳结束，使用凝胶成像分析系统拍照，分析PCR扩增结果，并记录。6.8 RFLP 酶切分析 全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 001342022
11、4 PCR扩增产物应用市售商品化的限制性内切酶Ava进行酶切，10 l酶切体系及反应条件如下：Ava内切酶0.5 l，10cutsmart Buffer 1 l，PCR产物5 l，去离子水3.5 l。将上述反应液混匀，约6000r/min瞬时离心，于37水浴中酶切消化4h。6.9 酶切产物电泳分析 10 l全部酶切产物中加入10DNA Loading Buffer约1 l，配制2.5%琼脂糖凝胶，以5V/cm恒压、40min50min电泳检测，电泳结束，使用凝胶成像分析系统拍照，观察每个个体的基因型，并记录。6.10 基因分型结果的判定 不同个体酶切产物结果呈现FecB的三种基因型。只有160
12、bp片段为基因纯合子（BB基因型）；有190bp和160bp两个片段为基因杂合子（B+基因型）；只有190bp片段为非携带者（+基因型）。如图1所示。图 1 基因分型结果 M：标准分子量pUC19DNA/Msp(Hap)marker；119为不同样本PCR产物的酶切结果，17为BB型，1、3、5、6、7、8、9、10、11、12、16、19为B+型，2、4、13、14、15、18为+型。6.11 标记辅助选择育种 根据育种群初生羔羊的FecB基因检测分型结果，淘汰+基因型羔羊，用于快速育肥生产商品肉羊，减少养殖成本；按照多胎绵羊育种计划开展FecB基因标记辅助选择育种，选留生产性能达标的理想型
13、BB基因型或携带B等位基因的公母羔羊作为核心育种群，加强羔羊护理和饲养管理。配种期，选择优秀的BB基因型或携带B等位基因公羊进行选种选配，实现多胎绵羊早期、准确、快速的选择、组群和配种，显著提高母羊产羔率和群体整体生产力，增加存栏羔羊的数量，提高育种效率和养殖经济效益。7 废弃物的处理 技术实施过程中产生的血液等废弃物应高温高压灭菌或其它方式灭菌以后再做处理，有毒有害废物应存放在密闭容器中，并符合GB/T31190相关要求。8 人员防护措施 全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 001342022 5 人员安全防护和预防交叉污染措施，应符合GB19489相关要求。A B -全国团体标准信息平台