1、第二章第二章 细胞工程的理论基础细胞工程的理论基础 山东师范大学生命科学学院山东师范大学生命科学学院 动物细胞与组织培养（cell and tissue culture）是动物细胞工程的重要技术基础。动物的细胞与组织培养是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。组织培养的概念组织培养的概念 组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。A：细胞培养：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养
2、于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。B：组织培养：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。C：器官培养：器官培养：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。体外培养的种类体外培养的种类 二、二、细胞培养的现实意义细胞培养的现实意义 生物技术上：生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹 症
3、等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白 细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。科学研究上：科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。临床医学上：临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾 病的治疗等 三、细胞培养的优点三、细胞培养的优点 1.1.研究的对象是活细胞研究的对象是活细胞 在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可力，并可长时间监控长时间监控、检测甚至定量评估一部分、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的情况，包括活细胞活细胞的形态、结构、生命的形态、结构、生命活动等。活动等。2.2.研究条件可以人为控制研究条件可以人为
4、控制 可以根据需要，控制包括可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。3.研究的样本可以达到比较均一性研究的样本可以达到比较均一性 通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。时，可采
5、用克隆化等方法使细胞达到纯化。4.4.研究内容便于观察、检测和记录研究内容便于观察、检测和记录 采用各种研究技术、记录方法：采用各种研究技术、记录方法：研究研究:倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流 式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原 位杂交、同位素标记位杂交、同位素标记-记录记录:摄影照片、缩时电影、电视摄影照片、缩时电影、电视-5.5.研究的范围比较广泛研究的范围比较广泛 学科多学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等
6、 对象广对象广：各种动物：低等动物各种动物：低等动物-高等动物高等动物-人类人类 一种动物：不同年龄一种动物：不同年龄-不同组织不同组织-正常或异常（肿瘤正常或异常（肿瘤-）6.6.研究的费用相对较经济研究的费用相对较经济 可提供可提供大量大量、同一时期同一时期、重复性好重复性好的、的、生物学性状生物学性状相似相似的实验对象的实验对象 四、细胞培养的缺点四、细胞培养的缺点 现人工模拟体内环境的技术已经很高现人工模拟体内环境的技术已经很高,但但,人工所模拟的条件人工所模拟的条件与与体内体内实际情况实际情况 仍仍不完全相同不完全相同.当细胞被置于当细胞被置于体外培养体外培养后后,生活在缺乏动态平衡
7、的环境中生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然久了，必然发生变化发生变化.因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能功能又具有某些改变的特定的细胞群体又具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将，而不能将之与体内的细胞完全等同。之与体内的细胞完全等同。五、细胞培养的工作原则五、细胞培养的工作原则 有标准化的工作方法有标准化的工作方法 培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKSHANKS液及液及 抗菌素等），应由专人负责，并保证
8、做到按规程行事，配抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。称、浓度、消毒与否和制备日期等。一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。消毒品与未消毒品应分别存放。第二节第二节 组织培养的细胞生物学组织培养的细胞生物学 一、体内外细胞的差异和分化一、体内外细胞的差异和分化（一）体
9、内外细胞的差异（一）体内外细胞的差异 培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现类似态，分化减弱或不显，出现类似“反祖反祖”现象；表现为细现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。1.与体内主要不同与体内主要不同 相对相对孤立孤立、相对单一、相对单一 缺乏体内的缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节系统作用、失去神经体液的调节 和细胞相互间的和细胞相互间的影响影响 2.主要表现主要表现 失去原有组织结构和细胞形态失去原有组织结构和细胞形态
10、 分化减弱或不显分化减弱或不显 细胞趋向细胞趋向单一化单一化；3.提示提示 要正确认识要正确认识体外培养细胞体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体。是一种特定条件下生长的细胞群体。（二）培养细胞的分化（二）培养细胞的分化 1不适应(Deadaption)：表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性的丧失.2脱分化或去分化(Dedifferentiation)细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。二、培养细胞形态分类二、培养细胞形态分类 体外细胞培养物的生长类型 按生长方式按生长方式:
11、2型型 粘附型粘附型细胞细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。悬浮型悬浮型细胞细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。的细胞。绝大多数绝大多数有机体细胞有机体细胞属粘附型属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。胞和白细胞可在悬浮状态下生长。贴附(粘附)型细胞 粘附粘附:是大多数有机体是大多数有机体细胞细胞在体内在体内 生存生存和和生长发育生长发育的的基本存在方式基本存在方式 含义含义 两两方面方面 结果结果 基于
12、粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须有机体的绝大多数细胞必须 粘附粘附于一于一固相表面固相表面 才能才能生存生存和和生长生长。培养时培养时：这些细胞被放到体外环境中以后：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞属于粘附型细胞。粘附粘附(锚定或锚着锚定或锚着)依赖型依赖型(性性)细胞：唯有粘附细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞于固相表面才能生存的细胞 类型类型 细胞在体内、外细胞在体内、外的的粘附粘附方式方式：存在差异
13、存在差异 体内体内：粘附粘附是是全方位全方位 外形外形具有具有复杂的立体特征复杂的立体特征 体外体外：多数情况，细胞只有多数情况，细胞只有一个附着平面一个附着平面 外形外形一般一般与体内时明显不同与体内时明显不同 按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类型几大类型 分类分类 根据形态大致的不同，主要根据形态大致的不同，主要2类：类：上皮细胞型上皮细胞型 成纤维细胞型成纤维细胞型 其它，不定型其它，不定型 上皮细胞型 名称：名称：仅形态上似体内仅形态上似体内，实际上不完全等于，实际上不完全等于-来源：来源：来源于外胚层来源于外胚层，内胚层细胞，内胚层
14、细胞 如：皮肤及其衍生物如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤上皮性肿瘤 形态：形态：类似类似体内的体内的上皮细胞上皮细胞 扁平扁平，不规则多角形不规则多角形，中有圆形核，中有圆形核 生长特点生长特点 易相连易相连成片成片 相靠相靠紧密相连紧密相连成成薄层薄层 铺石状铺石状 生长生长时呈时呈膜状膜状移动移动 很少很少脱离细胞群而脱离细胞群而单单个活动个活动 体外培养细胞类型（体外培养细胞类型（1）上皮细胞型上皮细胞型 成纤维细胞型 名称：名称：凡在凡在培养中形态与成纤维细胞类似培养中形态与成纤维细胞类似的的 来源：来源：由由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源
15、的组织的组织 如：真正的成纤维细胞如：真正的成纤维细胞 心肌心肌，平滑肌平滑肌，成骨细胞成骨细胞，血管内皮血管内皮 形态：形态：似体内成纤维细胞似体内成纤维细胞的形态的形态 胞体梭形胞体梭形或不规则三角形或不规则三角形 胞质向外伸出胞质向外伸出23个个长短不等的突起长短不等的突起 中有卵圆形核中有卵圆形核 生长特点生长特点 排列成排列成放射状放射状，漩涡，漩涡状状 并不紧靠连成片并不紧靠连成片，细胞细胞细胞接触易细胞接触易断开而断开而 单独行动单独行动 游离的游离的单独的单独的成纤维成纤维样细胞，样细胞，常有几个常有几个伸长的伸长的细胞突起细胞突起 体外培养细胞类型（体外培养细胞类型（2）成纤
16、维细胞型成纤维细胞型 贴附生长型贴附生长型-类型类型 1.与体内与体内同名的同名的细胞细胞不完全相同不完全相同 如：如：形态相似形态相似的成纤维细胞的成纤维细胞，可不同来源可不同来源 自 同 一 动 物 不 同 组 织 的 成 纤 维 样 细 胞 相 似 但自 同 一 动 物 不 同 组 织 的 成 纤 维 样 细 胞 相 似 但 发展趋向不同发展趋向不同 2.培养细胞的培养细胞的形态不稳定形态不稳定 条件改变条件改变，细胞形态细胞形态可有变化可有变化 培养细胞形态不稳定培养细胞形态不稳定 血清血清 Hela 高血清高血清 低血清低血清 成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细胞上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱太酸或太碱 标准标准pH 成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细胞上皮样细胞 细胞密度细胞密度 3T3 低密度低密度 高密度高密度 成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细胞上皮样细胞 生长状态改变生长状态改变 悬浮或贴附悬浮或贴附 悬浮悬浮 贴附贴附 圆形圆形 成纤维或上皮样成纤维或上皮样 转化与否转化与否 未转化未转化 转化后转化后 成纤维样成纤维样 可成上皮样可成上皮样 悬浮生长型