1、ICS 67.160.10 CCS X 62 团 体 TB 标 T/NAIA 0196-2023 葡萄酒中 16 种游离氨基酸的测定 液相色谱-串联质谱法 2023 04-03发布 2023 04-10实施 宁夏化学分析测试协会 发 布准全国团体标准信息平台前 言 本文件按照 GB/T1.1-2020 标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则规定编写。本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。本文件起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院（国家市场监督管理总局重点实验室（枸杞和葡萄 酒）、宁夏化学分析测试协会、宁夏农产品质量标准与检测技术研究所。本文件主要起草人：马桂娟、马雪梅、汤丽
2、华、王鹏、刘继辉、吴明、吕毅、张小飞、葛谦、陈盼盼、王琛、王泽岚。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台葡萄酒中游离氨基酸的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件规定了葡萄酒中 16 种游离氨基酸的液相色谱-串联质谱检测方法。本文件适用于葡萄酒中苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸含量的测定和确证。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件
3、。GB 5009.124-2016 食品中氨基酸的测定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 试样经亲水性液相色谱柱分离，液相色谱串联质谱仪测定，以保留时间定性，外标法定量。5 试剂与材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。5.1 试剂 5.1.1 甲酸铵：优级纯。5.1.2 甲酸：优级纯。5.1.3 乙腈：色谱纯。5.2 溶液配制 5.2.1 20mM 甲酸铵溶液（pH=3）：准确称取 0.126g 甲酸铵用水定容到 100mL,并用甲酸调节 pH 到3。5.2.2 甲酸铵-乙
4、腈溶液：取 20mM 甲酸铵溶液(5.2.1)50mL 用乙腈稀释定容至 500mL。5.2.3 0.1%甲酸水溶液：准确吸取 0.1mL 甲酸用水定容至 100mL。5.3 标准品 16 种氨基酸混合标准溶液：中文名称、英文名称、缩写、CAS 编号、浓度、相对分子质量等信息见附录 A。5.4 标准溶液制备 5.4.1 氨基酸混合标准储备液（18.7245.3mg/L）：准确吸取氨基酸混合标准溶液（5.3）1.0mL 于 10mL棕色容量瓶中用 0.1%甲酸水配制成氨基酸混合标准储备液。5.4.2 氨基酸混合标准中间液（1.8724.53mg/L）：准确吸取氨基酸混合标准储备液（5.4.1）1
5、.0mL 于10mL 棕色容量瓶中用 0.1%甲酸水配制混合标准中间液。5.4.3 标准曲线：根据需要，用初始流动相配制适当浓度的标准工作液，临用现配。6 仪器和设备 液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源(ESI)。7 分析步骤 全国团体标准信息平台7.1 试样制备 取原始样品 1kg 在瓷混样桶内充分混匀，将混匀样品置于洁净容器内密封，作为试样。7.2 试样的提取 取混合均匀的酒样经 0.1%甲酸水溶液适当稀释后过 0.22m 微孔滤膜，用于测定。7.3 标准曲线 将标准曲线工作液按浓度由低到高的顺序各取 10L 分别注入液质联用仪，以标准曲线工作液的质量浓度为横坐标，以定量离子峰面积为纵
6、坐标，绘制标准曲线。7.4 测定 7.4.1 液相色谱参考条件 a）色谱柱：亲水性硅胶色谱柱，2.1100mmmm，粒径3.5 m或性能相当者。b）柱温：40。c）流动相：A：20mM 甲酸铵溶液，B：甲酸铵-乙腈溶液；梯度洗脱见表1。d）流速：0.40mL/min。e)进样量：10L。表 1 流动相及梯度洗脱条件 时间/min 流速/（mL/min）流动相 A/%流动相 B/%0.00 0.40 0 100 2.00 0.40 10 90 8.00 0.40 20 80 13.00 0.40 40 60 15.00 0.40 40 60 15.10 0.40 0 100 18.00 0.40
7、 0 100 7.4.2 质谱参考条件 a）离子源：电喷雾离子源（ESI）。b）扫描方式：正离子扫描。c）检测方式：多反应监测（MRM）。d）离子源温度：330。e）气体流速：7L/min。f）雾化器压力：45psi。g）鞘气温度：390。h）鞘气流速：12L/min。i）毛细管电压：1500V。j）喷嘴电压：0V。k）定性离子对、定量离子对、碎裂电压、碰撞能量参考值见表 2。表 2 游离氨基酸的定性离子对、定量离子对、碰撞能量和碎裂电压参考值 子离子 化合物 保留时间(min)母离子(m/z)定量离子(m/z)碰撞能量 V 定性离子(m/z)碰撞能量 V 碎裂电压 V 苯丙氨酸 7.97 1
8、66.1 120.1 13 103 29 80 亮氨酸 8.46 132.1 86.1 9 30.2 17 75 异亮氨酸 8.75 132.1 86.1 9 44.2 25 75 全国团体标准信息平台甲硫氨酸 8.68 150.1 104 9 56.1 17 75 缬氨酸 9.71 118.1 72.1 9 55.1 25 70 脯氨酸 11.29 116.1 70.1 17 43.2 37 75 酪氨酸 8.27 182.1 136.1 13 91.1 33 85 丙氨酸 10.81 90.1 44.2 9 45.3 40 40 苏氨数 10.37 120.1 74.1 9 56.1 17
9、 75 甘氨酸 11.24 76 30.3 12 NA NA 35 丝氨酸 10.55 106.1 88.1 8 42.2 24 67 谷氨酸 12.37 148.1 84.1 17 130 5 75 天冬氨酸 12.84 134 88.1 9 74 13 70 组氨酸 14.82 156.1 110.1 13 83.1 29 90 精氨酸 14.43 175.1 70.1 24 60.1 12 100 赖氨酸 14.91 147.1 84.1 17 130.1 9 75 7.4.3 定量测定 根据试样溶液中被测物含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和待测样液中游离氨基酸的响应值
10、均应在仪器检测的线性范围内。标准溶液及试样溶液均按 7.4.1 和 7.4.2 规定的条件进行测定，游离氨基酸标准品的多反应监测（MRM）色谱图参见附录 B，采用初始流动相溶液配标，外标法定量。7.4.4 定性测定 如果试样溶液中检出的色谱峰与标准溶液的保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，目标化合物的定量离子和定性离子均出现。同时所选择离子的丰度比与标准样物质相关离子的相对丰度一致，相似度在允许偏差之内（见表 3），则可判定样品中存在对应的被测物。表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50 2050%1020 10 允许的相对偏差 20 25 30 50 7.5
11、 空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行。8 结果计算和表述 试样中游离氨基酸含量按式（1）进行计算：式中：X试样中游离氨基酸含量，单位为毫克每升（mg/L)；C C-测定溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；F试样的稀释倍数。9 精密度 在重复性测定条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15%。10 定量限 本方法游离氨基酸的定量限为 0.005mg/L。)1(1000 FCX全国团体标准信息平台 附录 A(资料性附录)16 种氨基酸的中文名称、英文名称、缩写、CAS 号、浓度、相对分子质量 16 种氨基酸的中文名称、英文名称、缩写、CAS 号、浓度、相对分子质量
12、见表 A.1。表 A.1 16 种氨基酸的中文名称、英文名称、缩写、CAS 号、浓度、相对分子质量 序号 中文名称 英文名称 缩写 CAS 编号 浓度（mg/L）相对分子质量（g/moL）浓度(moL/mL）1 L-天冬氨酸 L-Aspartic acid Asp 56-84-8 332.9 133.10 2.50 2 L-谷氨酸 L-Glutamic acid Glu 56-86-0 368 147.13 2.50 3 丝氨酸 L-Serine Ser 56-45-1 263.0 105.09 2.50 4 甘氨酸 Glycine Gly 56-40-6 187.2 75.07 2.50 5
13、 L-组氨酸 L-Histidine His 71-00-1 388 289.29 2.50 6 L-精氨酸 L-Arginine Arg 74-79-3 435 174.20 2.50 7 L-苏氨酸 L-Threonine Thr 72-19-5 298.1 119.12 2.50 8 L-丙氨酸 L-alanine Ala 56-41-7 222.4 89.09 2.50 9 L-酪氨酸 L-Tyrosine Tyr 60-18-4 453 181.19 2.50 10 L-缬氨酸 L-Valine Val 72-18-4 292.8 117.15 2.50 11 L-甲硫氨酸 L-Me
14、thionine Met 63-68-3 373 149.21 2.50 12 脯氨酸 Proline Pro 147-85-3 288 115.13 2.50 13 L-异亮氨酸 L-Isoleucine Ile 73-32-5 328.3 131.17 2.50 14 L-亮氨酸 L-Leucine Leu 61-90-5 327.5 131.17 2.50 15 L-苯丙氨酸 L-Phenylalanine Phe 63-91-2 413 165.19 2.50 16 L-赖氨酸 L-Lysine Lys 56-87-1 366 146.19 2.50 全国团体标准信息平台附录 B(资料性附录)游离氨基酸标准品的多反应监测（MRM）色谱图 游离氨基酸的多反应监测（MRM）总离子流图见图 B.1。图 B.1 游离氨基酸的多反应监测（MRM）总离子流图全国团体标准信息平台