1、ICS65.020.99CCS B 16JAASST/JAASS 682022团体标准草莓炭疽病菌检测技术规程Codes of practice for detection of strawberry anthracnose pathogens江苏省农学会发 布2022-10-21 实施2022-10-21 发布全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/JAASS 682022I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14实验室总体要求及工作人员操作要求.15仪器设备与试剂.16样品采集和贮运.27样品制备.28分子生物学鉴定.39结果判定.310样品保存与处理.311DN
2、A 及菌株保存与处理.312结果记录与保存.4附录 A（资料性）培养基的制备.5附录 B（资料性）草莓炭疽病相关资料.6附录 C（资料性）草莓炭疽病菌的培养性状和形态特征.8附录 D（资料性）草莓植株或栽培介质样本炭疽病菌鉴定报告.9全国团体标准信息平台T/JAASS 682022II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由江苏丘陵地区南京农业科学研究所提出。本文件由江苏省农学会归口。本文件起草单位：江苏丘陵地区南京农业科学研究所。本文件主要起草人：
3、唐冬兰、曹荣祥、蒋立奔、唐泉、张普娟、陈月红、郭成宝、须秋静、娄天成。全国团体标准信息平台T/JAASS 6820221草莓炭疽病菌检测技术规程1范围本文件规定了草莓炭疽病菌检测的试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、结果判定、样品保存与处理等。本文件适用于草莓植株及其栽培介质中炭疽病菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19495.22004 转基因产品检测 实验室技术要求GB/T 66822008 分析实验室用水规
4、格和试验方法GB/T 274022008 实验室质量控制规范 植物检疫SN/T 29652011 植物病原真菌分子生物学检测规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1目标 DNA 阳性对照positive DNA target control从可溯源的标准物质提取的DNA或从含有目标序列的阳性样品中提取的DNA，用于证明测试样品中的分析结果含有目标序列。3.2空白对照blank control无菌水溶液，用于证明检测试剂中不含有目标序列。4实验室总体要求及工作人员操作要求实验室总体要求及工作人员操作应符合GB/T 274022008的要求。5仪器设备与试剂全国团体标准信息平台T/JAA
5、SS 68202225.1仪器设备PCR仪、凝胶成像系统、台式离心机、纯水仪、电泳仪、漩涡振荡器、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌锅、电子天平、冰箱（4、-20）、制冰机、接种器械灭菌器、多样品组织研磨仪。培养皿、镊子、手术剪、手术刀、移液器、带滤芯吸头（10 L、200 L和1000 L）、滤纸、离心管（100 L、1.5 mL、10 mL和50 mL）、钢珠、封口膜。5.2主要试剂葡萄糖、琼脂、氨苄青霉素、链霉素、次氯酸钠、70%乙醇、DNA聚合酶、引物、无毒核酸染料、裂解缓冲液、真菌DNA提取试剂盒。马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的制备参见附录A。本文件所有试剂均为分析纯，实验用水应符合G
6、B/T 6682-2008的规定。6样品采集和贮运对草莓植株进行取样时，各个部位包括叶片、叶柄、根茎、匍匐茎和果实等均可用于检测，采样前观察待检植株有无病症或其它生长不良情况，并进行拍照及记录。栽培介质样品通常取与植株根系结合紧密的土壤或基质5 g10 g。取样工具提前采用121 2（1.1105Pa）高压灭菌的方式进行消毒处理。取样过程中佩戴一次性手套，每取1个样品后，用75%乙醇对取样工具进行擦拭消毒，每份样品单独置于一次性自封袋中并编号。采集的样品立即放于添加冰块或冰袋的保温箱中，送至实验室，保存于4 冰箱中备用。7样品制备7.1DNA 提取和质量检查7.1.1 DNA提取植物组织或栽培
7、介质的DNA采用商业试剂盒进行提取，提取步骤详见试剂盒说明书，每个样品提取3个平行样。7.1.2 DNA质量检查将提取的DNA取3 L进行琼脂糖凝胶电泳，DNA样品电泳后呈现出一条明显而清晰的条带，可用于分子生物学鉴定；也可用分光光度计检测DNA样品的OD260与OD280比值，当OD260/OD280的值在1.82.0之间时，可用于分子生物学鉴定。7.2病原菌预培养7.2.1 植株中病原菌的预培养将待检样品用流水冲洗后，经70%乙醇消毒10 s，1%NaClO消毒1 min，无菌水漂洗3次4次，然后在无菌滤纸上吸干表面水分，将待检组织分成3 mm5 mm的小段，置于PDA培养基上，28 条件
8、下培养48 h。全国团体标准信息平台T/JAASS 68202237.2.2 栽培介质中病原菌的预培养取2 g栽培介质放入200 mL无菌水中，在摇床上振荡30 min，使其充分混匀，悬浮液稀释10倍，取0.5 mL稀释液，涂抹于5个培养皿中的PDA平板上，28 条件下培养48 h。7.2.3 菌落PCR检测模板的制备对经28 培养48 h后的PDA培养基表面长出的可见菌落进行目测，将疑似炭疽病菌株的菌落（参见附录C），用无菌牙签挑取适量菌丝，加入含有100 L 0.5 mol/L NaOH（pH）的1.5 mL无菌离心管中，管中加入2颗无菌钢珠，将离心管放入组织研磨仪，50 Hz条件下研磨6
9、0 s，再以6000 rpm的转速离心1 min，取5 L上清液加入300 L Tris-HCl（pH=8.0）中用于后续分析。8分子生物学鉴定8.1 PCR扩增特异引物采用特异性引物进行扩增，目标片段为389 bp，引物序列如下：正向引物CgInt：5-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG-3反向引物Cg478R：5-TTTACGGCAAGAGTCCCTCC-38.2 PCR反应PCR反应体系总体积10 L，包含：2Es Taq MasterMix（含Taq DNA Polymerase、3mM MgCl2和400 M each dNTP）5 L，引物（10 M）各0.5 L，模板0.5
10、 L，无菌水4 L。PCR反应程序：96 预变性5 min；96 变性30 s，60 退火45 s，72 延伸1 min，35个循环；72 反应7 min。取5 L扩增产物用1%（w/v）琼脂糖凝胶进行电泳分离，无毒核酸染料染色后凝胶成像，观察是否出现目标片段大小的条带。当以从待检样品中直接提取的DNA为检测模板时，可通过加大模板量，增加反应次数，或采用二次PCR等方法来提高目的片段的检出率。每次检测均需设阳性对照和空白对照。9结果判定当阳性对照扩增出389 bp的目的条带、空白对照无扩增产物的情况下，若待检样品中出现预期大小的特征条带，判定检测结果呈阳性；若待检样品中未出现预期大小的扩增条带
11、，则判定检测结果呈阴性。10样品保存与处理样品无论检出炭疽病菌与否，均需经登记和经手人签字后妥善保存，保存于4 冰箱中6个月，以备复验，保存期满后，需经高压灭活（121 灭菌15 min）后方可处理。11DNA 及菌株保存与处理全国团体标准信息平台T/JAASS 6820224从检测样品中提取的DNA，保存于-20 冰箱中，至少保存1年；从样品中分离并鉴定为炭疽病菌的菌落，经纯化后，保存于25%甘油中存于-20 冰箱，至少保存1年。保存期满后高压灭活处理。12结果记录与保存实验记录建立档案，保存2年。记录内容包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法、主要使用仪器和结果等，必要时形成鉴
12、定报告（格式参见附录D），由实验人员和审核人员签字。全国团体标准信息平台T/JAASS 6820225附 录A（资料性）培养基的制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）马铃薯去皮后洗净，切成小块，称取 200 g，蒸馏水中煮 30 min，用 4 层纱布过滤，加入 20 g 葡萄糖、16 g20 g 琼脂，加热使之完全溶解，蒸馏水定容至 1000 mL，121高压灭菌 15 min。为抑制细菌生长，在培养基加热融化后温度降到 50 左右时，加入经过滤灭菌过的氨苄青霉素（使用浓度为 0.25g/L）和链霉素（使用浓度为 0.1 g/L），充分混匀再倒平板。全国团体标准信息平台T/JAASS 6820
13、226附 录B（资料性）草莓炭疽病相关资料B.1 草莓炭疽病基本信息中文名：草莓炭疽病英文名：strawberry anthracnose disease病原菌分类地位：半知菌亚门、类腔菌纲、黑盘孢目、黑盘孢科、刺盘孢菌属（Colletotrichum spp.）。B.2 分布地区草莓炭疽病是草莓生产上的世界性病害，我国草莓产区均有发生和危害。草莓各个部位在整个生育期均可受该病危害，尤以育苗期及定植初期发病最重，当根颈部位被感染时可导致整株死亡。B.3 为害状叶片感染时形成黑色或浅灰色的圆形病斑，常类似墨水渍（图 B.1）。叶柄和匍匐茎感染时，病斑起初小，有红色条纹，之后迅速扩展为深色、略凹陷
14、的硬斑，当叶柄上的病斑逐渐扩大，环绕叶柄后可引起叶片萎蔫死亡（图 B.2）。果实染病，表现为淡褐色、水渍状的斑点，并迅速发展为硬的圆形病斑，病斑通常会变成暗褐色至黑色。病原菌若侵染根颈部位，最初的症状是病株在水分胁迫期间（如夏季）的午后表现萎蔫。将萎蔫植株的根颈部位纵切开，可见红褐色斑纹，随着病害的发展，最终可造成整株萎蔫和死亡（图 B.3）。图 B.1 草莓炭疽病叶片为害状全国团体标准信息平台T/JAASS 6820227图 B.2 草莓炭疽病匍匐茎（左）和叶柄（右）为害状图 B.3 草莓炭疽病根颈部位为害状（左）和根颈部位被侵染后引起的植株萎蔫状（右）B.4 病原菌目前已知可引起草莓炭疽病
15、的种主要有草莓炭疽菌（C.fragariae Brooks）、尖孢炭疽菌（C.acutatumJ.H.Simmonds）、胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides(Penz.)Penz.&Sacc.）及束状炭疽菌（C.dematium(Pers.)Grove），各个种存在不同的地理分布特征。其中胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌实际为复合种。基于广泛采样及多基因座分析，胶孢炭疽菌中的暹罗炭疽菌（C.siamense Prihastuti&Hyde）和果生刺盘孢菌（C.fructicola Prihastuti&Hyde）是目前多地的优势种。B.5 病害流行炭疽病的发生流行与多种因素有关，主要包括品种
16、、田间菌源量、气候条件及栽培管理措施等。田间感染源包括种苗、土壤、植株残体及中间寄主。本菌的侵染不需要伤口，可于无症状植株组织上产生附着器及分生孢子，或在侵染末期于寄主组织上形成分生孢子盘，内有呈黏液状聚集的分生孢子，借雨水喷溅传播。夏季持续高温高湿可导致草莓炭疽病发病严重，冬春低温干燥时该病发生较轻。全国团体标准信息平台T/JAASS 6820228附 录C（资料性）草莓炭疽病菌的培养性状和形态特征暹罗炭疽菌形态特征如图 C.1 所示。说明：APDA 培养基上菌落正面观；BPDA 培养基上菌落背面观；C分生孢子形态。图 C.1 暹罗炭疽菌形态特征果生刺盘孢形态特征如图 C.2 所示。说明：APDA 培养基上菌落正面观；BPDA 培养基上菌落背面观；C分生孢子形态。图 C.2 果生刺盘孢形态特征ABCABC全国团体标准信息平台T/JAASS 6820229附 录D（规范性）草莓植株或栽培介质样本炭疽病菌鉴定报告样品种类取样地点取样时间样品来源样品数量取样部位送检日期送检人/单位联系电话检测鉴定方法：主要使用仪器（品牌、型号）：检测鉴定结果：备注：鉴定人（签名）：审核人（签名）：鉴定单位