1、ICSICS 67.05067.050 CCSCCS X X 2424 团团 体体 标标 准准 T/NAIA 02032023 枸杞中芦丁、山奈酚和异鼠李素的测定枸杞中芦丁、山奈酚和异鼠李素的测定 高效液相色谱高效液相色谱-质谱法质谱法 Determination of Rutin、Kaempferol and Isorhamnetin in Lycium barbarum L by HPLC-MS/MS 2023-04-10 发布 2023-04-17 实施 宁夏化学分析测试协会宁夏化学分析测试协会 发发 布布 全国团体标准信息平台 T/NAIA 02032023 前前 言言 本文件按照 G
2、B/T 1.1-2020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则规定编写。本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。本文件起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院（国家市场监管重点实验室（枸杞和葡萄酒质量安全）、宁夏工商职业技术学院、宁夏回族自治区食品质量监督检验二站、宁夏化学分析测试协会 本文件主要起草人：汤丽华、朱燕燕、马桂娟、陈盼盼、赵娟、王琛、王泽岚、郭阳、李强、辛世华、赵瑞、张小飞。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台 T/NAIA 02032023 枸杞中芦丁、山奈酚和异鼠李素的测定 高效液相色谱-质谱法 1 1 范围范围 本文件规定了枸杞中芦丁、山奈酚和异鼠李素的
3、高效液相色谱质谱检测方法。本文件适用枸杞中芦丁、山奈酚和异鼠李素的定性和定量测定。2 2 规范性引用文件规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 NY/T 3950 植物源性食品中 10 种黄酮类化合物的测定 高效液相色谱-串联质谱法 T/NAIA 050 枸杞及其制品中二氢槲皮素的测定 高效液相色谱法 3 3 术语和定义术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 4 方法提要方法提要 试样经甲醇溶液超声提取后，
4、经反相色谱柱分离，以保留时间定性，用高效液相色谱-质谱仪测定和确证，外标法定量。5 5 试剂和材料试剂和材料 本方法所用的试剂，除另有规定外，均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。5.5.1 1 试剂试剂 5.1.15.1.1 乙腈：色谱纯。5.1.25.1.2 甲醇：色谱纯。5.1.35.1.3 甲酸：优级纯。5.1.45.1.4 0.1%甲酸溶液：1mL 甲酸用水定容到 1000mL。5.1.55.1.5 80%甲醇溶液：取 80mL 甲醇和 20mL 水混合均匀。5.25.2 标准品标准品 5.2.5.2.1 1 标准品：芦丁（Rutin，CAS 号 153-18-4，C2
5、7H30O16）、山奈酚（Kaempferol，CAS 号520-18-3，C15H10O6）、异鼠李素（Isorhamnetin，CAS 号 480-19-3，C16H12O7），纯度均98%。5.2.5.2.2 2 混合标准储备液（1.0mg/mL）：分别准确称取芦丁、山奈酚、异鼠李素标准品 10mg（准确至 0.1mg），于 10mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，4保存。5.2.35.2.3 混合标准中间液（100g/mL）：分别准确吸取芦丁、山奈酚、异鼠李素标准储备液各 1.0mL于 10mL 容量瓶中，用 0.1%甲酸溶液：乙腈=90：10（体积比）定容。5.2.5.2.4 4
6、 混合标准使用液：根据需要，用空白基质溶液配制成适当浓度的混合标准使用液，临用现配。全国团体标准信息平台 T/NAIA 02032023 6 6 仪器和设备仪器和设备 6.16.1 液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源(ESI)。6.26.2 分析天平：感量 0.1mg 和 0.01g。6.36.3 涡旋混合器。6.46.4 高速离心机：最大转速 10000r/min。6.6.5 5 超声波发生器。6.66.6 匀浆机。6.76.7 高速粉碎机。7 7 分析步骤分析步骤 7.17.1 试样制备试样制备 枸杞鲜果、枸杞干果等取代表性样品经匀浆机或高速粉碎机匀浆粉碎后均匀分装，密闭常温或冷藏保存
7、。7.27.2 试液的提取试液的提取 称取试样 1.0g（精确到 0.01g）置于 50mL 离心管中，加入 80%甲醇溶液（5.1.5）10mL，超声提取 10min，8000r/min 离心 5min，上清液经 0.22m 微孔滤膜过滤后，上机待测。7.37.3 仪器参考条件仪器参考条件 7.3.17.3.1 液相色谱参考条件液相色谱参考条件 7.3.1.1 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18，2.1 mm*100 mm，粒径 3.5m 或性能相当。7.3.1.2 柱温：40。7.3.1.3 流动相：A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈；梯度洗脱见表 1。7.3.1.4 流速
8、：0.30mL/min。7.3.1.5 进样量：10L。表表 1 1 流动相及梯度洗脱条件流动相及梯度洗脱条件 时间/min 流速/（mL/min）流动相 A/%流动相 B/%0.00 0.30 90 10 2.00 0.30 90 10 4.00 0.30 70 30 6.00 0.30 50 50 8.00 0.30 20 80 10.00 0.30 20 80 10.10 0.30 90 10 12.00 0.30 90 10 7.3.27.3.2 质谱参考条件质谱参考条件 7.3.2.1 离子源：电喷雾离子源（ESI）。7.3.2.2 扫描方式：负离子扫描。全国团体标准信息平台 T/N
9、AIA 02032023 7.3.2.3 检测方式：多反应监测（MRM）。7.3.2.4 离子源温度：325。7.3.2.5 气体流速：6L/min。7.3.2.6 雾化器压力：45psi。7.3.2.7 鞘气温度：350。7.3.2.8 鞘气流速：11L/min。7.3.2.9 毛细管电压：3500V。7.3.2.10 喷嘴电压：500V。7.3.2.11 定性离子对、定量离子对、碰撞能量等参数参见附录 A。7.47.4 定量测定定量测定 根据试液中被测物含量情况，选定浓度相近的基质混合标准使用液，基质混合标准使用液和待测试液中被测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。基质混合标准使用液与试
10、液等体积进样测定。标准溶液及试液均按 7.3.1 和 7.3.2 规定的条件进行测定，如果试液中与标准溶液相同的保留时间有峰出现，则对其进行确证，芦丁、山奈酚和异鼠李素的参考保留时间见表 2。芦丁、山奈酚和异鼠李素标准品的多反应监测（MRM）色谱图参见附录 B，采用基质溶液校准曲线外标法定量。表表 2 2 参考保留时间参考保留时间 被测物名称 保留时间/（min）芦丁 4.651 异鼠李素 6.745 山奈酚 7.842 7.57.5 定性测定定性测定 经确证分析被测物质色谱峰保留时间与标准物质相一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，所选择的离子均出现。同时所选择离子的丰度比与标准溶液中相关离子
11、的相对丰度一致，相似度在允许偏差之内（见表 3），则可判定样品中存在对应的被测物。表表 3 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50%20%至 50%10%至 20%10%允许的相对偏差 20%25%30%50%7.67.6 空白试验空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行。8 8 分析结果的表述分析结果的表述 试样中芦丁、山奈酚和异鼠李素含量按式（1）进行计算：式中：)1(10001000mVcX全国团体标准信息平台 T/NAIA 02032023 X 试样中各种化合物含量，单位为微克每千克（g/kg）；c 试样溶液浓度，单位为纳克每毫
12、升（ng/mL）；V 试样的定容体积，单位为毫升（mL）；m 试样质量，单位为克（g）。注：测定结果用平行测定的算数平均值表示，保留两位有效数字。9 9 精密度精密度 在重复性测定条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。1010 定量限定量限 本方法的芦丁、山奈酚的定量限为 0.5mg/kg，异鼠李素定量限为 0.05mg/kg。全国团体标准信息平台 T/NAIA 02032023 附录附录 A A(资料性附录资料性附录)芦丁、山奈酚和异鼠李素的质谱参数芦丁、山奈酚和异鼠李素的质谱参数 表表 A.1A.1 芦丁、山奈酚和异鼠李素的质谱参数芦丁、山奈酚和异鼠李素的质谱
13、参数 被测物名称 母离子(m/z)子离子(m/z)碎裂电压(V)碰撞能量(eV)300.5*120 25 芦丁 609.1 271.6 120 25 151.0*80 25 山奈酚 299.1 163.8 80 25 300.2*135 14 异鼠李素 315.2 151.0 135 14 全国团体标准信息平台 T/NAIA 02032023 附录附录 B B(资料性附录资料性附录)芦丁、山奈酚和异鼠李素的色谱图芦丁、山奈酚和异鼠李素的色谱图 图图 B.1B.1 芦丁、山奈酚和异鼠李素的总色谱图芦丁、山奈酚和异鼠李素的总色谱图 全国团体标准信息平台 T/NAIA 02032023 图图 B.2B.2 芦丁、山奈酚和异鼠李素的多反应监测（芦丁、山奈酚和异鼠李素的多反应监测（MRMMRM）色谱图）色谱图 全国团体标准信息平台